2. 济宁医学院医学影像与检验学院, 济宁 272067
2. School of Medical Imaging and Laboratory, Jining Medical University, Jining 272067, China
结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是全球第三大高发恶性肿瘤，其死亡率亦高居癌症相关死亡第三位[1]。据2021年统计数据显示，全球新增CRC病例超190万，死亡病例达93.5万，分别占癌症总发病及死亡人数的10%[2]。值得注意的是，约90%的CRC患者死亡与转移直接相关——转移不仅是CRC恶性进展的核心特征，更是当前临床治疗的主要瓶颈。因此，系统解析CRC转移的关键分子机制并筛选可干预的分子靶点，已成为突破治疗困境的迫切需求。
肿瘤转移是导致癌症患者死亡的首要原因，约占肿瘤相关死亡的90%[3]。作为恶性肿瘤治疗的核心挑战之一，靶向肿瘤迁移与侵袭的干预策略已成为突破预后瓶颈的研究焦点[4]。其中，信号转导与转录激活因子3(STAT3)作为关键调控枢纽，可通过持续激活介导肿瘤细胞增殖、侵袭及转移，尤其CRC中，STAT3的异常活化与临床分期及耐药性显著相关，使其成为极具潜力的治疗靶标[5-6]。STAT3作为驱动肿瘤恶性进展的核心转录因子，其靶向治疗策略已从基础研究快速迈向临床转化。目前针对STAT3通路的干预手段主要包括：阻断IL-6/JAK等上游信号介导的STAT3异常激活；抑制STAT3蛋白二聚化或DNA结合能力；降解STAT3 mRNA或蛋白稳定性[7]。核因子E2相关因子2(Nrf2)是细胞氧化应激应答的核心调控因子，通过激活抗氧化反应元件(ARE)驱动的基因表达(如HO-1、NQO1)维持氧化还原稳态[8-10]。多项研究表明，各种癌症中，Nrf2信号通路的结构性激活会促进癌细胞的生长和增殖，阻止细胞凋亡，增强癌症干细胞的自我更新，更重要的是，会增强癌细胞的化疗耐药性和放射耐药性[11-13]。因此，阻断Nrf2信号通路也是一种很有前途的癌症治疗方法，特别是对于Nrf2水平升高的癌症。据报道，Nrf2和STAT3之间可能存在串扰，导致STAT3的表达减少，Nrf2的转录活性降低，以及其靶基因的表达降低[14]。
自1970年代双四氢异喹啉生物碱被发现以来，其独特的化学结构、强效生物活性及作用机制持续吸引学界关注。其中，Et743(Trabectedin/Yondelis®)作为首个获批的抗癌代表药物(适应证涵盖耐药性软组织肉瘤及卵巢癌)，已在美国、欧洲等地临床应用，印证了该类化合物的抗癌潜力。基于此，我们团队前期设计合成了新型双四氢异喹啉生物碱Renieramycin T(RT)，并发现其可显著抑制小鼠黑色素瘤B16F10细胞的迁移与侵袭(浓度依赖性效应)，且对多种肿瘤细胞展现出强细胞毒性[15-17]。然而，RT是否通过相似机制调控CRC细胞的转移行为仍属未知，这一科学盲点或为揭示CRC转移机制提供全新突破口。
本研究聚焦新型双四氢异喹啉生物碱RT，旨在阐明其对CRC细胞迁移与侵袭的抑制作用及分子机制，以填补RT在转移性CRC研究中的空白，为开发靶向转移微环境的治疗策略提供实验依据。
1 材料与方法 1.1 材料RT由我们课题组自主合成[17]；HCT116细胞(北纳生物，北京，BNCC287750)；BSA(碧云天生物技术股份有限公司，上海，ST023-200g)；脱脂奶粉(碧云天生物技术股份有限公司，上海，P0216-300g)；CCK-8细胞活性试剂盒(同仁化学研究所，日本，CK04)；结晶紫染色液(凯基生物技术股份有限公司，南京，KGE1202-100)；DMEM(BI公司，以色列，C3103-0500)；PBS(BI公司，以色列，C3581-0500)；血清(BI公司，以色列，C04001-050X10)；双抗(Gibco公司，美国，UB89609)；Trypsin(Gibco公司，美国，25300054)；细胞划痕插件(Ibidi公司, 德国，80469)；ECL显影液(万类生物科技有限公司，沈阳，WLA006a)；转膜缓冲液(10×)(雅酶生物医药科技有限公司，上海，PS109S)；TBST(10×)(雅酶生物医药科技有限公司，上海，PS103S)；WB电泳液(壹生命，北京，MOPS001)，预制胶4%~12%(壹生命，北京，Gel41215)；STAT3、p-STAT3、Nrf2(武汉三鹰生物技术有限公司，武汉，10253-2-AP；80199-2-RR；16396-1-AP)。
Cytation 5多功能酶标仪(Berton公司，美国)；光学显微镜(尼康，日本)；37 ℃，5% CO2培养箱(Thermo SCIENTIFI，美国)；蛋白成像仪(Tanon，上海)。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养将HCT116细胞置于培养基(DMEM+10%FBS+1%PS)中，放置于37℃，5%CO2培养箱中培养适宜时间，定期观察细胞生长的状态和密度。在培养过程中，HCT116细胞需要进行传代操作。取出6cm培养皿，显微镜下观察细胞状态和密度，确认细胞密度达到70%~80%时进行传代，一般按照1∶4~1∶2的比例传代。细胞洗涤，吸出旧培养基，加入适量PBS轻轻摇晃后吸出，以去除残留血清。细胞消化，加入适量胰酶，轻轻摇晃确保覆盖细胞层，37 ℃孵育20 s左右，迅速向培养皿中加入含有血清的培养基，终止消化。一般按照消化液与培养基1∶2的体积比加入培养基。然后进行吹打细胞，使细胞完全脱落下来，并形成均匀的单细胞悬液。根据实验需求和细胞生长情况，将细胞悬液分装入新的培养皿中。将分装好细胞的培养皿放入37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，注意将培养皿轻轻放置，避免晃动使细胞分布不均。实验分组为对照组(HCT116细胞培养于培养基中，空白对照)、THP-1与HCT116细胞的共培养组(CM组)、CM+RT 20nM组(共培养体系基础上添加20nM RT)和CM+RT 80nM组(共培养体系基础上添加80nM RT)。
1.2.2 细胞活性检测采用RT处理贴壁的HCT116细胞，继续放于恒温培养箱中培养。待细胞密度为40%左右时加入待测化合物孵育48h后，弃掉培养基，加入CCK-8检测试剂，在避光条件下每孔加入7μL CCK-8，置于37℃，5%CO2恒温孵育箱内20~40min，随后利用波长为450nm的酶标仪检测细胞的吸光度。此实验重复3次。
1.2.3 细胞迁移实验在12孔板上插入细胞迁移插件，在THP-1细胞上清液诱导的HCT116细胞模拟肿瘤微环境下，在每个小孔中接种密度为30%左右的细胞。当细胞生长到密度为80%时, 此时插件周围都长满，这时拔除插件会形成一个500μm的宽度并在显微镜(尼康，日本)下观察、拍摄并保存T0时刻的图像。随后，加入RT置于37℃，5%CO2的培养箱24h，经过24h的药物处理后，再次观察、拍摄和保存24h的图像。利用Image J(V.1.8.0.112)软件对细胞划痕实验结果进行定量分析。此实验重复3次。
1.2.4 Transwell实验用不完全培养基稀释Matrigel至浓度9~12μg/ml，垂直加入Transwell小室中，使其均匀平铺在底部，注意均匀铺胶，不要产生气泡。随后置于37℃孵育1~3h。加入100μL不含血清的培养基，放置于37℃培养箱孵育30min，进行水化。用200μL的无血清培养基混合20和80nM的RT。然后，在下层培养室内加入500μL含有10%胎牛血清和1%PS的细胞培养基，在THP-1细胞上清液诱导的HCT116细胞模拟肿瘤微环境下，接种1.5×104的细胞密度与Transwell上室。扩散后，将细胞置于培养箱中24h，用结晶紫染色。最后，用倒置显微镜(尼康，日本)拍照。此实验重复3次。
1.2.5 Western blotting实验使用细胞裂解液lysis buffer裂解RT处理的THP-1细胞上清液诱导的HCT116细胞模拟肿瘤微环境的细胞模型提取蛋白。蛋白提取物经SDS-PAGE电泳，进行分离，然后将胶上的蛋白转移至PVDF膜。用5%脱脂奶粉封闭1h后，然后将PVDF膜分别与以下一抗：兔抗STAT3抗体(1∶2000)、兔抗p-STAT3(1∶1000) 和兔抗Nrf2(1∶1000)进行孵育。一抗孵育完成后，用TBST洗3次，在室温条件下将洗过的膜与HRP-偶联的兔二抗孵育1h。然后使用ECL显影液进行显影。此实验重复3次。
1.3 统计学方法统计分析采用Graphpad prism软件。两组间的差异采用双尾t检验进行分析。3组及以上采用ANOVA单因素方差分析，LSD事后多重比较评估其显著性，P＜0.05为差异显著。
2 结果 2.1 RT对HCT116细胞的抑制效果RT对HCT116细胞具有较高的敏感性，并且其细胞活力受到显著抑制。通过定量计算得知RT对HCT116细胞的IC50为0.1μM。见图 1。
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图 1 ET743及其RT的化学而结构式及RT对HCT116细胞的抑制活性 注：A.ET-743结构式；B.RT化学结构式; C.HCT116细胞的细胞活性随RT浓度的变化曲线。 |
通过划痕实验检测发现，与对照组相比，肿瘤微环境下CM组HCT116细胞的迁移能力显著增强(迁移率增加了约30%)，而RT处理显著减弱了CM+RT 20nM组和CM+RT 80nM组HCT116细胞的迁移能力(F=1712，P＜0.001)。在20nM RT处理下，细胞迁移率降低了约30%，而在80nM RT处理下，迁移率进一步降低至约20%(图 2A和2B)。此外，侵袭实验结果显示，肿瘤微环境显著促进了HCT116细胞的侵袭能力，而RT处理部分逆转了这一促进作用(F=119.3，P＜0.001)。经20nM RT处理，细胞侵袭率降低了约40%，而经80nM RT处理，细胞侵袭率进一步降低至30%左右(图 2C和2D)。
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图 2 RT对HCT116细胞迁移和侵袭的影响 注：A.不同浓度RT对HCT116细胞迁移速率的影响, 显微镜下照片; B.HCT116细胞伤口愈合面积统计数据, 与对照组相比，aP＜0.05；与CM组相比，bP＜0.05；与CM+RT 20nM组相比, cP＜0.05；C.不同浓度RT对HCT116细胞侵袭的影响，显微镜下照片; D.HCT116被入侵细胞数量的统计数据, 与对照组相比，aP＜0.05;与CM组相比，bP＜0.05；与CM+RT 20nM组相比, cP＜0.05。 |
Western blotting结果表明在肿瘤微环境下，STAT3、p-STAT3和Nrf2的蛋白表达水平显著升高，表明肿瘤微环境促进了这些蛋白的表达。然而，RT处理能够部分抑制STAT3、p-STAT3和Nrf2的表达。RT对STAT3的抑制作用具有显著性(F=20.27, P＜0.001)，对p-STAT3的抑制作用更为显著(F=23.01, P＜0.001)，同时对Nrf2的表达也表现出显著的抑制效果(F=9.550, P＜0.05)(图 3A~3D)。此外，RT显著抑制了HCT116细胞中STAT3的磷酸化，并下调了Nrf2的表达。
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图 3 Western blotting验证RT抑制HCT116细胞的迁移和侵袭的机制 注：A.采用Western blotting检测STAT3、p-STAT3和Nrf2蛋白的表达；B.分析HCT116细胞中STAT3蛋白的相对表达水平，与对照组相比，aP＜0.05;与CM组相比，bP＜0.05;与CM+RT 20nM组相比，cP＜0.05;C.分析HCT116细胞中Nrf2蛋白的相对表达水平，与对照组相比，aP＜0.05;与CM组相比，bP＜0.05;与CM+RT 20nM组相比，cP＜0.05;D.分析HCT116细胞中p-STAT3蛋白的相对表达水平，与对照组相比，aP＜0.05;与CM组相比，bP＜0.05；与CM+RT 20nM组相比，cP＜0.05。 |
基于以上研究结果，我们提出了以下模型，见图 4。此外，我们发现RT对HCT116细胞的迁移和侵袭具有明显的抑制作用。对其潜在机制的探索表明，RT减弱了STAT3的磷酸化，并下调了Nrf2的表达。
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图 4 RT抑制HCT 116细胞迁移和侵袭模型 |
在全球每年所有癌症和与癌症相关的死亡病例中，CRC约占10%[18]。转移是癌症的特征之一，占癌症患者死亡率的90%以上[19]。转移是一种全身性疾病，需要系统的治疗方法；筛查、化疗、靶向治疗和免疫治疗是预防和治疗转移性CRC的主要方法[20]。发现早期诊断的新靶点，了解其分子机制，制定靶向治疗策略，是推动转移性CRC精准治疗的重要基础。
RT是一种天然的海洋衍生的四氢异喹啉生物碱，其独特的化学结构使其能够靶向调控肿瘤微环境中的关键信号节点[21-23]。本研究RT能够以浓度依赖性的方式抑制THP-1细胞上清诱导的HCT116细胞的迁移和侵袭。此外，Western blotting结果显示，RT可抑制STAT3的磷酸化和Nrf2的表达。RT减弱了STAT3的磷酸化并下调了Nrf2的表达，来抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。未来需深入解析靶点间的分子交互，并推进转化研究以验证其临床应用价值。
RT可能通过多种机制抑制CRC细胞的迁移和侵袭。本研究表明RT通过调控Nrf2-STAT3信号通路来抑制肿瘤细胞的转移。Nrf2是一种转录因子，参与调控抗氧化反应和细胞保护机制。已有研究表明，Nrf2在多种癌症中高表达，并通过促进肿瘤细胞的存活和转移来发挥促癌作用。STAT3则是一种关键的信号分子，参与调控细胞增殖、存活、迁移和侵袭。Nrf2和STAT3之间存在复杂的相互作用，Nrf2通过调控STAT3的活性来影响肿瘤细胞的转移。RT通过抑制Nrf2的活性，进而抑制STAT3的磷酸化和核转位，从而抑制STAT3介导的下游基因表达，如基质金属蛋白酶(MMPs)、血管内皮生长因子(VEGF)等，这些基因在肿瘤细胞的迁移和侵袭中起关键作用。RT还可能通过抑制EMT过程来抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。EMT是肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要过程，Nrf2-STAT3信号通路在EMT过程中起重要作用。Nrf2-STAT3信号通路在CRC转移中起重要作用。Nrf2通过调控抗氧化反应和细胞保护机制，促进肿瘤细胞的存活和转移。STAT3则通过调控细胞增殖、存活、迁移和侵袭，促进肿瘤细胞的转移。Nrf2可以通过调控STAT3的活性来影响肿瘤细胞的转移。
Nrf2-STAT3信号通路与其他信号通路之间存在复杂的相互关系。例如，Nrf2可以通过调控PI3K/AKT信号通路来影响肿瘤细胞的存活和转移。PI3K/AKT信号通路在肿瘤细胞的存活、增殖和转移中起重要作用，Nrf2可以通过调控PI3K/AKT信号通路来影响肿瘤细胞的存活和转移。Nrf2还可以通过调控NF-κB信号通路来影响肿瘤细胞的炎症反应和转移。NF-κB信号通路在肿瘤细胞的炎症反应和转移中起重要作用，Nrf2可以通过调控NF-κB信号通路来影响肿瘤细胞的炎症反应和转移。STAT3通过上调抗凋亡蛋白(如Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1)的表达，抑制肿瘤细胞凋亡，增强其存活能力，从而促进转移。STAT3通过调控肿瘤微环境中的免疫细胞(如肿瘤相关巨噬细胞TAMs和调节性T细胞Tregs)和炎症因子(如IL-6、IL-10)，促进免疫逃逸和肿瘤转移。
与其他RT的类似化合物相比，RT可能具有更高的选择性和更低的毒性。RT可能通过特异性地抑制Nrf2-STAT3信号通路来抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭，而不影响正常细胞的存活和功能。此外，RT可能具有更好的药代动力学特性，如更高的生物利用度和更长的半衰期，从而提高其治疗效果。
总之，本研究探究了RT在CRC中的抗肿瘤作用，尤其是探讨了RT对CRC细胞迁移和侵袭方面的作用，并初步揭示了其通过抑制Nrf2-STAT3抑制CRC转移的分子机制。该研究为CRC尤其是转移性CRC的治疗提供新的思路及依据。
利益冲突：所有作者均申明不存在利益冲突。
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