2. 河北农业大学生命科学学院，保定 071001
2. College of Life Sciences, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, China
山药(Dioscorea opposita Thunb) 是我国传统的药食同源性植物[1]，为薯蓣(Dioscoreaceae)地下块茎，国内种植十分广泛[2]，富含多糖、尿囊素、维生素、微量元素、氨基酸、胆碱等多种功能性成分[3-5]，其中多糖类被认为是最主要的活性成分[6]，具有抗氧化、抗衰老、防癌、免疫调节、降血糖、调血脂等功效[7]，常用于中药组方和保健食品开发。
药用植物的产量和质量不仅与品种、气候条件以及生态环境有关，还与根际土壤微生物的多样性及丰富度密切相关[8]，根际土壤微生物可以通过改善土壤的理化性质[9]、调节土壤营养[10]，进而影响药用植物功能性成分的积累[11-12]。
本研究选用不同产地成熟期的山药作为研究对象，采用高通量测序技术分析根际土壤中细菌和真菌多样性，并对其进行功能预测，结合各产地山药多糖含量的测定结果，揭示山药根际土壤微生物的优势功能菌群的种类及与多糖积累之间的关联，对于促进药用植物的优质高产、增强抗逆能力及抵御病原菌侵害等具有现实指导意义。
1 材料与方法 1.1 样本采集本研究选用国家地理标志产品原产地河北蠡县、河南焦作和湖北武穴成熟期(9~10月份)的山药作为研究对象，“抖根法”采集不同产地山药种植地块的根际土壤[13]，同地块“五点采样法”采集土壤样品，3次重复，将混合均匀的土壤样品，装入无菌自封袋，同时收集新鲜山药根茎，冷链带回实验室，并保存于-80℃冰箱[14]；不同产地的山药饮片由安庆医药高等专科学校中药鉴定与炮制教研室提供并鉴定。采样信息见表 1。
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表 1 不同山药种植地区土壤样本信息表 |
用CTAB法进行土壤总DNA抽提，DNA浓度和纯度检测合格后，对DNA进行扩增，细菌16SrRNA引物使用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′) 和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，真菌ITS使用ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)。扩增参数：95℃预变性3min，27个循环(95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，真菌片段扩增35个循环数)，72℃稳定延伸10min，最后在4℃进行保存(PCR仪：ABI GeneAmp® 9700型)。每个样本3个重复，将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收，Tris_HCl洗脱，检测合格后将回收产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行定量。
在Illumina MiSeq平台(PE300)(上海美吉生物医药科技有限公司)构建文库，对原始测序序列质控、拼接后，使用UPARSE软件对97%的相似度的序列进行OTU聚类并剔除嵌合体，利用RDP classifier对每条序列进行物种分类注释，分类置信度阈值为0.7。比对Silva数据库和Unite数据库，并进行功能预测。测序序列已提交至NCBI，BioProject登录号为PRJNA936564。
1.2.2 多糖含量测定及差异性分析新鲜山药洗净去皮，称取50g左右的样品，打碎后移入500mL圆底烧瓶中加入约200mL的无水乙醇，在90℃的恒温水浴锅中回流提取3h，然后用布氏漏斗抽滤，取沉淀。重复一次后，合并沉淀并放入90℃烘箱中烘干至恒重，放入干燥箱中保存备用；饮片进行打粉后干燥处理。
取1g粉末，加入30mL蒸馏水，超声提取(时间120min、功率100W，温度75℃)离心过滤，取上清液，减压浓缩后，加入4倍体积95%的乙醇，4℃中放置24h，收集多糖沉淀，置于60℃烘箱中干燥2d。
取40μg/mL的葡萄糖标准溶液(0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60mL)均加水至2mL，分别加入1mL 6%的苯酚溶液，混匀，再加入5mL浓硫酸充分混匀后，置于30℃水中反应20min，在490nm处测定其吸光值，以0.0mL管为对照，以葡萄糖含量为横坐标，吸光值A为纵坐标，绘制标准曲线并得出曲线方程用于计算。取浓度为1mg/mL的山药多糖200μL，其余步骤同标准曲线，根据吸光度平均值计算含量。
不同产地山药多糖含量利用SPSS22.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析和t检验，用F-test检验正态性，P＜0.05表示差异有统计学意义，随机进行LSD(Least Significant Difference)多重比较，考查不同产地样本之间多糖含量的显著差异。
2 结果与分析 2.1 微生物群落多样性与组成 2.1.1 Alpha多样性分析HJX细菌的ACE指数、Chao指数和OTUs数量均最大，说明河南焦作种植区的山药根际土壤细菌群落丰富度和多样性均高于其他样本；HLZ真菌的Simpson指数、ACE指数、Chao指数以及OTUs数量均最大，说明河北蠡县种植区的山药根际土壤真菌群落丰富度和多样性高于其他样本。见表 2。
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表 2 土壤微生物Alpha多样性指数分析 |
物种注释细菌分属于35个门，109个纲，232个目，350个科，617个属，OTUs 2010个。见表 3。
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表 3 不同样本根际土壤细菌在分类水平上的物种分布 |
不同地区样本细菌的优势菌群为放线菌门(Actinobacteriota)、变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)；纲水平的优势菌群为放线菌纲(Actinobacteria)和γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)；优势菌在不同样本中的相对丰度差异较大。除共有的主要优势菌以外，不同分类水平上HLX样本主要优势菌还包括拟杆菌门(Bacteroidota)，拟杆菌纲(Bacteroidia)；HWX还包括纤线杆菌纲(Ktedonobacteria)，HJX优势菌还包括嗜热油菌纲(Thermoleophilia)，HLX的绝对优势细菌放线菌门(Actinobacteriota)和放线菌纲(Actinobacteria)丰度均最高。根据属水平相对丰度热图可知属水平的优势菌群为节杆菌属(Arthrobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)和单胞菌属(Sinomonas)。见表 4，图 1。
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表 4 优势细菌的物种分布 |
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图 1 细菌群落属水平的丰度热图 |
物种注释根际土壤中真菌分属于9个门，29个纲，46个目，130个科，248个属，OTUs 579个。见表 5，图 2。
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表 5 不同样本根际土壤真菌在分类水平上的物种分布 |
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图 2 真菌群落属水平的丰度热图 |
从表 6可知，不同地区样本根际土壤真菌的优势菌群为子囊菌门(Ascomycota)、被孢霉门(Mortierellomycota)和担子菌门(Basidiomycota)；纲水平的优势菌群为粪壳菌纲(Sordariomycetes)、被孢霉纲(Mortierellomycetes)、散囊菌纲(Eurotiomycetes)、座囊菌纲(Dothideomycetes)、银耳纲(Tremellomycetes)；除共有优势菌粪壳菌纲(Sordariomycetes)和座囊菌纲(Dothideomycetes)以外，HWZ和HLZ优势菌均包括散囊菌纲(Eurotiomycetes)，HWZ和HJZ均包括锤舌菌纲(Leotiomycetes)，HJZ和HLZ均包括伞菌纲(Agaricomycetes)；HWZ独有银耳纲(Tremellomycetes)；HJZ独有被孢霉纲(Mortierellomycetes)，HLZ独有虫囊菌纲(Laboulbeniomycetes)。HLZ的绝对优势菌群子囊菌门(Ascomycota)和粪壳菌纲(Sordariomycetes)丰度均最高。
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表 6 优势真菌在分类水平上的物种分布 |
属水平的优势菌群为头束霉属(Cephalotrichum)、被孢霉属(Mortierella)、黄丝曲霉属(Talaromyces)、沙蜥属(Saitozyma)、青霉菌属(Penicillium)。HWZ样本的优势菌属及相对丰度主要为沙蜥属(Saitozyma)(22.41%)，黄丝曲霉属(Talaromyces)(22.41%)，青霉素属(Penicillium)(12.47%)，镰孢菌属(Fusarium)(8.46%)；HJZ主要为被孢霉属(Mortierella)(43.24%)，Cephalotrichum(8.07%)，Setophoma(6.41%)；HLZ主要为头束霉属(Cephalotrichum)(44.67%)，Coprinellus(8.34%)。
2.2 微生物群落结构 2.2.1 微生物群落的Beta多样性根据Beta多样性分析构建层级聚类树，可知HJX和HLX的细菌群落结构聚类相似性高于HWX，HWZ和HLZ的真菌群落结构聚类相似性高于HJZ。
2.2.2 微生物群落的OTUs根据根际土壤微生物的OTUs韦恩图，HWX、HJX、HLX样本中检测到细菌OTUs分别有985、1070、995个，其中共有OTUs为220个。HWZ、HJZ、HLZ样本中检测到真菌OTUs分别有226、238、337个，其中共有OTUs为46个。湖北武穴的细菌特有OTUs数量最多；河北蠡县的真菌特有OTUs数量最多，表明湖北武穴样本的细菌群落结构和河北蠡县样本的真菌群落结构特异性更强。
从图 3可知，HJZ和HLZ 2个样本的细菌共有OTUs有731(占比24.25%)个，真菌共有OTUs有141个(占比36.37%)，均高于其他样本交集，说明两地样本细菌和真菌的群落组成呈现相似性，其次为湖北武穴和河北蠡县的样本细菌和真菌的共有OTUs数量。
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图 3 根际土壤细菌(左)和真菌(右)的OTUs venn图 |
山药多糖测定得到的标准曲线方程：y=0.0072x-0.0154，R2值为0.9952。将测得的吸光度平均值(RSD值均小于3%)带入标准曲线中计算，乘以0.9进行换算校正[15]。由表 7可知，不同产地的新鲜山药和饮片测得的多糖含量均呈现：河北蠡县＞湖北武穴＞河南焦作，且新鲜山药多糖含量均高于饮片。差异性分析结果显示P＜0.05，具体统计学意义，LSD多重比较表明不同产地样本在含量上两两之间均存在显著差异。
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表 7 不同产地新鲜山药以及饮片的多糖含量差异性分析 |
利用PICRUSt2对细菌群落进行功能预测，获得OTUs在COG、KEGG各功能水平的注释信息，功能预测共有新陈代谢、环境信息处理、遗传信息处理、细胞过程、有机系统和与人类疾病有关的6大类，包括46个二级功能，其中新陈代谢是相对丰度最高的一级代谢通路，在HWX、HJX、HLX中分别可达42.5%、41.0%和40.7%，包含的二级功能主要为碳水化合物代谢、氨基酸代谢、脂类代谢、能量代谢、维生素的代谢、核苷酸代谢、萜类化合物和聚酮的代谢以及其他次级代谢产物的生物合成等。预测得到Enzyme/KO的丰度热图得出河北蠡县的细菌群落各项功能的丰度均高于湖北武穴和河南焦作，结合多糖含量测定结果，推测细菌群落结构与多糖含量相关联。如图 4。
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图 4 细菌群落KO功能分布热图 |
利用FUNGuild可获得样本中真菌菌群的功能分类及丰度信息，从图 5看出不同样本真菌群落功能预测结果差异较大，腐生营养型(saprotroph)的功能丰度最高，且河北蠡县的样本真菌群落功能预测腐生营养型(saprotroph)丰度高于湖北武穴和河南焦作；其次为病理营养型(pathotroph)，对应的预测优势类群有Undefined Saprotroph、Fungal Parasite-Undefined Saprotroph、Fungal Parasite-Plant Pathogen-Plant Saprotroph、Animal Pathogen-Endophyte-Lichen Parasite-Plant Pathogen-Soil Saprotroph-Wood Saprotroph、Plant Pathogen、Dung Saprotroph-Plant Saprotroph-Wood Saprotroph。腐生营养型(saprotroph)预测的真菌群落可促进活性物质的积累，与河北蠡县多糖含量最高保持一致。
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图 5 FUNGuild功能分类统计柱状图 |
河北蠡县和湖北武穴丰度最高的功能预测结果均为未定义腐生真菌(undefined saprotrophs)；河北蠡县预测结果丰度较高的还包括Plant Pathogen(1280)和Dung Saprotroph-Plant Saprotroph-Wood Saprotroph(1129)；湖北武穴预测结果丰度较高的还包括Fungal Parasite-Undefined Saprotroph(13326) 和Animal Pathogen-Endophyte-Lichen Parasite-Plant Pathogen-Soil Saprotroph-Wood Saprotroph(4706)；河南焦作功能丰度最高为Endophyte-Litter Saprotroph-Soil Saprotroph-Undefined Saprotroph(21400)，其次为Undefined Saprotroph(12383)和Fungal Parasite-Plant Pathogen-Plant Saprotroph(3219)。
对应的真菌种类有被孢霉属(Mortierella)、镰孢霉属(Fusarium)、小球腔菌属(Leptosphaeria)与沙蜥属(Saitozyma)等，其功能预测的高丰度表现与其在微生物群落组成中较高的相对丰度相对应，说明微生物群落中的优势菌群是代谢过程中的主要功能菌群。河北蠡县预测结果高丰度类型对应真菌有Coprinopsis，不属于群落结构中的优势菌群，说明群落结构中低丰度的菌群也可能会参与代谢过程，在后续研究中需要关注低丰度的微生物菌群的功能分类。
3 讨论通过高通量测序分析河南焦作、河北蠡县和湖北武穴3个产地山药根际土壤微生物群落结构组成，结果表明河南焦作种植区的山药根际土壤细菌多样性最丰富，河北蠡县种植区的山药根际土壤真菌多样性最丰富。不同种植区样本土壤细菌群落结构中优势细菌类别一致，但是相对丰度差别较大；真菌群落结构中优势菌类别组成和相对丰度呈现明显差异。根据微生物的OTUs韦恩图分析，河南焦作和河北蠡县产区的土壤细菌和真菌共有OTUs均占比最大，湖北武穴的细菌特有OTUs和河北蠡县的真菌特有OTUs数量均最多。细菌层级聚类河南焦作和河北蠡县相似性最高，真菌群落结构呈现湖北武穴和河北蠡县聚类相似性最高。
放线菌门(Actinobacteriota)、变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)在不同产地样本细菌分类中均占绝对优势，其中河北蠡县样本的放线菌门(Actinobacteriota)和变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度均最高。有研究发现，放线菌门(Actinobacteriota)、厚壁菌门(Firmicutes)可以产生抗菌物质，有益于药用植物根际土壤的生态稳定性以及病原菌危害的生物防治[16]。变形菌门(Proteobacteria)在各种植物根际均比较活跃[17]，是多种药用植物以及农作物[18-21]根际微生物研究中的优势菌群。放线菌纲(Actinobacteria)和γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)是最优势菌纲，变形菌门(Proteobacteria)分类下的γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)和α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)作为优势菌被报道具有许多促生长细菌(PGPR)种属[22]和大量能与植物共生的其他固氮细菌[23]，可以释放植物激素、促进植株生产和代谢，以及抵抗病原菌危害[24]。与其他两地样本不同，河北蠡县土壤样本主要优势菌中包含拟杆菌门(Bacteroidota)，曾被报道会影响土壤的电导率等理化性质，改变整体细菌的群落结构，进而参与植物活性物质代谢和积累[25]。
子囊菌门(Ascomycota)、被孢霉门(Mortierellomycota)、担子菌门(Basidiomycota)相对丰度总和均占各地区样本中真菌群落总丰度的95%以上，占明显优势，作为河北蠡县样本中的优势菌群，头束霉属(Cephalotrichum)能产生多种有益的次级代谢产物[26]，被孢霉属(Mortierella)是土壤中常见的有益微生物，据报道能产生多种生物活性物质，能促进土壤肥力提升，有助于改善土壤微环境，有效促进药用植物活性物质的积累[27]。
多糖含量测定结果表明，不同产地新鲜山药以及山药饮片多糖含量均呈现显著差异，且河北蠡县多糖含量均最高，湖北武穴次之。功能预测显示河北蠡县的微生物群落丰度高于湖北武穴和河南焦作。不同样本真菌群落功能预测结果呈现功能分类及丰度信息差异较大，总体表现为腐生营养型(saprotroph)和病理营养型(pathotroph)为主要类型，对应真菌种类分析表明土壤根际的优势菌群是主要的功能预测菌群。河北蠡县的样本腐生营养型(saprotroph)的丰度最高，河北蠡县和湖北武穴丰度最高的功能预测结果均为未定义腐生真菌(undefined saprotrophs)，说明土壤样本中腐生营养型(saprotroph)所对应微生物种群越丰富，越利于山药根茎生长及活性物质积累等代谢过程，并且与真菌菌群的功能相关性更大。已有研究表明药用植物根系与多种真菌可以形成菌根共生体系，通过调节活性物质生物合成关键酶基因的表达[28]，从而增加萜烯类、类黄酮类等活性物质[29]的积累，药用植物可溶性蛋白和可溶性糖的积累明显上升[30]。
总之，河北蠡县样本中优势细菌放线菌门(Actinobacteriota)、变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidota)，以及优势真菌头束霉属(Cephalotrichum)均具有促进药用植物生长代谢的功能，并与功能预测对应类群相一致。河北蠡县与湖北武穴的聚类分析真菌菌群相似度高，多糖含量上保持接近，说明山药活性成分的积累与根际土壤微生物多样性尤其是真菌群落结构组成有关，对于后期山药种植过程中从根际微生物角度调节土壤养分，为优质高产植株的选育，促生产生物菌剂的开发提供理论依据。
利益冲突：所有作者均申明不存在利益冲突。
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