2. 济宁医学院附属医院病理科, 济宁 272029
2. Department of Pathology, Affiliated Hospital of Jining Medical University, Jining 272029, China
肿瘤出芽是各种高度恶性癌症中常见的病理学现象，通常作为疾病的预后指标，用来预测患者的整体生存率和疾病复发率。因所涉及的肿瘤细胞具有转移性和干细胞特性，肿瘤出芽是恶性肿瘤从局部向远处转移的一个关键步骤。探究其分子生物学特点和细胞行为学特点可能为恶性肿瘤的治疗提供新的思路。
1 肿瘤出芽概述 1.1 肿瘤出芽的定义肿瘤出芽是一种存在于多种实体癌中的病理现象，自1949年被日本学者Imai报道以来，一直备受人们关注。关于肿瘤出芽的定义，目前最为公认的是2016年国际肿瘤出芽共识会议所提出的：在高倍显微镜下位于肿瘤浸润前沿, 散在的呈未分化状态的肿瘤细胞小簇，细胞数目为1至4个[1]。
1.2 肿瘤出芽的特征在组织学上，肿瘤出芽多出现于腺癌，如食管、胃、胆囊、胰腺、结直肠等处，其次是鳞癌，如皮肤、口腔、肺，在尿路上皮癌中也可观察到。通过HE染色或细胞角蛋白免疫组化，可观察到肿瘤出芽细胞呈圆形、细长型或呈现非典型性的形态特征，其连接复合物表达降低或缺失，且没有微绒毛[2]。通过将肿瘤出芽连续的切片进行三维重建表明，肿瘤出芽不是静态过程，而是呈现动态变化，肿瘤延伸出许多指状突起投射到邻近的间质中，每个突起包含许多细胞，随后这些细胞与原发肿瘤分离为小细胞集群，即为肿瘤出芽[3]。
1.3 肿瘤出芽的临床意义2016年4月在伯尔尼举行的国际肿瘤出芽共识会议上，就基于证据的标准化肿瘤出芽评分系统达成共识：肿瘤出芽是pT1结直肠癌淋巴结转移的独立预测因子；肿瘤出芽是Ⅱ期结直肠癌生存率的独立预测因素；肿瘤出芽是结直肠癌术前活检中一个不利的预后因素。在其他实体性肿瘤中，肿瘤出芽也被视为一种组织学预后标志物，用来预测淋巴结转移、淋巴管或血管侵犯、化疗-放疗抵抗、局部复发和远处扩散[4]。无论在疾病的初期还是其他阶段，出芽等级越高，复发率越高，患者整体生存率也就越差[5]。
1.4 肿瘤出芽的分子背景在生物学上，肿瘤出芽是肿瘤微环境(TEM)的一部分，目前绝大多数研究都将其看成上皮－间充质转化(EMT)的形态学表现。EMT被认为与肿瘤细胞运动能力、侵袭力和抗凋亡能力的增强相关，在EMT过程中，上皮细胞变得更加细长，形态为梭形，呈纤维母细胞样，经历极性丧失、伪足形成和E钙黏蛋白相关细胞-细胞黏附解体[6]。在肿瘤出芽中也可发现EMT的一些特征，如细胞骨架重排(例如肌动蛋白重组)、细胞运动和侵袭、细胞相关蛋白水解活性增加和基因表达重编程[7]。然而，这些特征在肿瘤出芽中缺乏统一性，并且由于没有单细胞迁移，肿瘤出芽被解释为细胞集体迁移的混合上皮/间充质表型[8]。对于肿瘤出芽的研究，目前绝大多数都是在组织学上进行，而忽视了其作为一个动态转化过程的特性。
2 肿瘤出芽的过程及相关分子学改变 2.1 癌细胞的解离肿瘤出芽的发生发展是多阶段的动态连续过程，其第一步被认为是肿瘤细胞从原发肿瘤的解离。癌细胞间黏附作用降低是癌细胞侵袭转移关键。已知E-钙粘蛋白是参与细胞黏附和维持上皮细胞结构的钙黏蛋白家族的成员，其可以作为锚定连接点，在介导上皮细胞与细胞间黏附中发挥重要作用。多项研究表明，肿瘤出芽中E-钙黏蛋白表达下调或数目减少，并受多种因子调控。其中，转化生长因子β(TGF-β)可以通过激活SMAD蛋白家族调控EMT相关基因的转录，增加E-钙黏蛋白抑制因子如Snail、Slug、Twist、ZEB1，ZEB2的表达[9]。Pavlic ˇ等[2]率先使用激光捕获显微切割技术获得结直肠癌中特定肿瘤出芽组织，其进一步的研究结果表明，肿瘤出芽中E-钙黏蛋白抑制因子ZEB2表达上调。
除了E-钙黏蛋白，上皮细胞黏附分子(Ep-CAM)被发现在肿瘤出芽细胞上缺乏膜性表达，而细胞质中Ep-CAM染色却高度增加[10]。膜性Ep-CAM的缺失也会导致细胞-细胞黏附降低，促进肿瘤细胞解离，增加迁移能力和肿瘤出芽。Ep-CAM启动子由Wnt-β-连环蛋白-TCF4复合体进行调控，其表达的转录抑制因子为EMT诱导转录因子ZEB1[11]。
2.2 肿瘤出芽细胞的迁移和侵袭肿瘤细胞的侵袭机制较为复杂，主要包括细胞黏附的失调、细胞外基质(ECM)分解和细胞转移3个部分。出芽细胞在与原发肿瘤解离后，首先需要黏附在细胞外基质上，接着降解ECM，为癌细胞的浸润创造环境，并通过降解的基质进行移动。其中整合素是ECM的主要黏附分子，其激活和与ECM的结合可引起一系列黏附素的聚集[12]。层粘连蛋白5γ2(LN-5γ2)作为整合素配体，在结直肠癌、口腔鳞癌和肺鳞癌的肿瘤出芽细胞中均有表达。在结直肠癌中，LN-5γ2和整合素β1通过激活黏着斑激酶(FAK)和Yes相关蛋白(YAP)转录共激活物和PDZ结合基序(TAZ)，促进了肿瘤出芽[13]。已知YAP是Hippo通路的转录辅激活子和下游元件，其功能是调节器官大小和凋亡。当脱离Hippo通路的负调控时，YAP被初步证明是一个原癌基因，诱导主要的癌症特征，如癌症干细胞特性、细胞极性丧失和转移。而FAK的激活在促进其他黏附分子磷酸化及整合素信号通路传导中起着核心作用。
基质金属蛋白酶(MMPs)由恶性肿瘤细胞刺激产生，是降解ECM的关键酶[14]。在侵袭前沿，MMPs可将LN-5切割为LN-5γ2，使其具有类似表皮生长因子(EGF)的作用，从而有助于肿瘤生长和侵袭[15]。在乳腺浸润性导管癌中，来自肿瘤出芽和来自侵袭前沿肿瘤块的癌细胞中都有类似的MMPs表达，且基质细胞中肿瘤出芽等级与MMPs表达的结合可显著提高预后评估的准确性[16]。Sogawa等[17]在结肠癌病例中发现MMP9的高表达和基因扩增，小鼠和人中MMP9的近端启动子序列包含转录因子β-连环蛋白/TCF/LEF、糖皮质激素受体(GR)和NF-κB的保守结合位点，且小鼠MMP9启动子可通过β-连环蛋白信号刺激剂氯化锂(LiCl)被激活。这进一步支持了β-连环蛋白在结直肠癌侵袭转移中的重要作用。
此外，尿激酶(UPA)驱动的细胞外基质降解也可能是导致肿瘤出芽的众多因素之一。Märkl等[18]在出芽中的结肠癌细胞中发现了LN-5和尿激酶型受体(UPAR)的共表达。UPA与其受体UPA-R结合，激活其蛋白水解活性，促进细胞外基质降解，进而促进肿瘤细胞的侵袭和迁移。UPA是Wnt/β-连环蛋白途径和TGF-β信号通路的共同靶点，转录抑制因子ZEB1是最终的下游效应因子，ZEB1通过组蛋白乙酰转移酶p300与UPA启动子直接结合，从而增强UPA的表达[19]。
RAF激酶抑制蛋白(RKIP), 也称为磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP), 是一种肿瘤转移抑制蛋白，其可通过抑制NFkB/Snail回路来抑制EMT进程[20]。RKIP在肿瘤芽中的表达明显低于肿瘤主体[21]，RKIP本身也可作为高级别肿瘤出芽的预测因子，肿瘤芽自身的RKIP丢失似乎参与了肿瘤的转移过程，并导致肿瘤侵袭性的增加[22]。
2.3 肿瘤出芽中的免疫抵抗在肿瘤出芽中存在免疫反应，CD8+T细胞、FOXP3+T细胞和CD68+巨噬细胞是结直肠癌肿瘤出芽区中最常检测到的免疫细胞[7]。TGF-β激活的SMADS与转录激活蛋白5(STAT5)和活化T细胞核因子(NFAT)合作，诱导幼稚CD4+T细胞的叉头状转录因子3(FOXP3)表达，从而促进其向调节性T细胞表型分化。在TGF-β刺激的CD8+T细胞中，SMADS与转录因子ATF1协同抑制涉及CD8+T细胞裂解功能的几个基因的启动子，直接抑制CD8+T细胞的细胞毒性程序，这些可能有助于肿瘤细胞的免疫抑制与免疫逃避[23]。
程序性细胞死亡配体1(PD-L1) 是一种表达于肿瘤细胞表面的膜蛋白，在与其受体程序性细胞死亡1蛋白(PD-1) 后，可抑制肿瘤微环境中CD8+T淋巴细胞的细胞毒活性，促使肿瘤细胞逃避免疫系统监视。而PD-L1在肿瘤出芽区域高表达，并与EMT有关[24]。此外，Martinez-Ciarpaglini等[25]发现，PD-L1过表达的基因谱与EMT表达谱之间存在显著相关性：ZEB1和ZEB2增加，miR200a和miR200c表达减少。而miRNA被认为是EMT的激动剂或抑制剂。miR-200表达下调被认为与肿瘤出芽高度相关。这些发现表明，PD-L1过表达可能与肿瘤出芽中逃避免疫反应有关。
趋化因子中，正常T细胞表达和分泌调节活化因子(RANTES)又称CC型趋化因子配体5(CCL5), 在免疫调节、自身免疫紊乱和炎症中起着至关重要的作用。在结直肠癌中，巨噬细胞来源的CCL5通过p65/STAT3-CSN5-PD-L1途径来抑制CD8+T细胞对癌症的反应，促进癌细胞的免疫逃逸[26]。Chang等[27]研究表明肿瘤来源的CCL5通过CCL5/CCR5轴增强T调节细胞中TGF-β的分泌，从而阻断CD8+T细胞的杀伤功能，有助于肿瘤的免疫逃避行为。Gao等[28]研究发现在结直肠癌中，肿瘤出芽分泌高水平的CCL5，其可以通过CCR5溶质载体家族25成员24(SLC25A24)途径招募成纤维细胞，并导致在侵袭前沿的肿瘤芽周围形成特征性成纤维细胞簇。癌相关成纤维细胞(CAF)和肿瘤细胞之间的串扰可导致成纤维细胞活化，随后导致肿瘤转移和免疫抑制等。
2.4 肿瘤出芽细胞的增殖和凋亡β-连环蛋白在肿瘤主体内呈细胞膜、质阳性，在浸润前沿(即出芽的肿瘤细胞)中呈细胞核阳性，此为目前获得普遍认可且特异性较强的用于证实肿瘤出芽的免疫标志物[29]。在经典Wnt信号通路中，β-连环蛋白是主要调控因素。正常情况下，体内Wnt不活跃，β-连环蛋白会被胞浆内糖原合成酶激酶(GSK)-3β磷酸化而泛素化，再被蛋白酶体降解掉[30]。而当受到外界刺激，如APC基因突变，细胞外Wnt配体被激活，Wnt与Frizzle-Axin-LRP-5/6复合物结合后，胞浆GSK-3β被隔离，β-连环蛋白的磷酸化则不能完成[31]。至此，低磷酸化的β-连环蛋白在胞浆中的积累允许其迁移到细胞核，并通过在细胞核内与淋巴增强因子(LEF)或T细胞因子(TCF)形成复合物来激活靶基因，以促进细胞增殖以及存活而不分化[32]。
与原发肿瘤相比，肿瘤芽显示出较低的核Ki-67水平和caspase-3、较高的核p16INK4和细胞周期蛋白D1[7]，这即表明肿瘤出芽处于低水平的增殖和凋亡状态，且生长停滞。因此，为维持其存活，大部分芽必须具有一些抗凋亡机制，如抗失巢凋亡(指当正常的上皮细胞失去了与细胞外基质的连接时触发的一种特殊的程序性细胞死亡方式)。嗜神经性酪氨酸受体激酶B(TrkB)是一种强有力的失巢凋亡抑制因子，与原发肿瘤相比，它在肿瘤出芽中显著过度表达[33]。然而，肿瘤出芽中抗失巢凋亡的具体机制仍未明确。另外，肿瘤芽通常过表达干细胞标记物，如LGR5、ALDH1和CD44，这表明它们可能具有自我更新的能力，无论是在原发部位还是远处转移组织[34]。
3 小结与展望综上所述，肿瘤出芽过程中肿瘤细胞分离、迁移和侵袭能力的增强与各种细胞因子和分子水平变化密切相关，其恶性表型的维持有赖于各种分子途径和基因的调控，如WNT信号通路、TGF-β信号通路以及miR-200microRNA的下调。了解肿瘤出芽的分子机制及动态分子变化，一方面有助于提高临床实践中肿瘤出芽评估的准确性和全面性，另一方面也可为临床干预疾病提供潜在的治疗靶点。然而，肿瘤出芽相关的细胞和分子生物学较为复杂，有关其确切的分子机制仍需要进一步深入探究。
利益冲突：所有作者均申明不存在利益冲突。
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