肾缺血-再灌注损伤是急性肾损伤(acute kidney injury, AKI)的主要原因之一。35%~70%AKI病例为肾前病变[1]，损伤以缺血造成的缺氧、再灌注导致的炎症反应为主[2]。当损伤达到肾实质细胞后，将激发免疫反应[3]，从而激发进一步的信号通路[4-6]。其中，氧化应激和炎症反应起着重要作用[7]。
二氢槲皮素(Dihydroquercetin, DHQ)是一种二氢黄酮类化合物，广泛存在于自然界，其结构的特殊性决定了其具有较强的抗炎抗氧化特性、调节酶活性以及影响淋巴细胞行为的生物活性[8]。DHQ可通过抑制活性氧簇/NLRP3炎症小体表现对糖尿病肾病起到肾脏保护作用[9]。因此，我们推测DHQ对肾缺血-再灌注损伤在抗氧化方面有保护作用，且作用时间应在给药10min后。本文以血清肌酐(serum creatinine, Scr)、尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、过氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)水平、肾脏细胞形态以及球囊比为检测指标，探讨DHQ对肾缺血-再灌注损伤模型大鼠的保护作用。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 动物健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠，体重200~250g，由青岛大任富城畜牧有限公司提供。本动物实验符合动物伦理学要求(编号：2019-YX-011)。
1.1.2 主要试剂DHQ(西安玉泉生物科技有限公司)；苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin staining, HE)染色液(无锡市江原实业技贸总公司)；肌酐(Cr)试剂盒、尿素氮(BUN)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物科技有限公司)；过氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)。
1.2 方法 1.2.1 动物分组与造模大鼠24h自然光，26℃室温和60%左右湿度条件下适应性饲养一周，允许自由饮食。随机将大鼠分为3组，空白对照组(control组)、肾缺血-再灌注损伤模型组(model组)和DHQ组，每组6只，术前禁食12h。DHQ组在造模前10min灌胃给药(100mg/kg)，3组大鼠均通过腹腔注射10%水合氯醛(3ml/kg)麻醉，control组不做处理。model组和DHQ组造模：在大鼠距脊柱和左右两侧季肋下缘0.5cm处，开一纵向1cm切口，逐层钝性分离筋膜，剪开肌肉层，在靠近脊柱的方向找到肾脏，将肾脏小心从切口夹出，分离肾动脉后，双侧夹闭，数秒至十数秒后可见肾脏逐渐转变为苍白色，说明肾脏处于缺血状态，缺血操作成功。45min后开放再灌注，可见肾脏逐渐恢复鲜红，说明再灌注成功，进行缝合操作。24h后，取血取材，做如下检测。
1.2.2 肾脏病理形态学观察采用上述相似步骤，将左侧肾脏冠切成大小近似的两部分，分开置于中性福尔马林中固定12h。依次将标本清水冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片机切片，HE染色。进行病理学观察，并且评估肾小管损伤情况。
1.2.3 血清Scr和BUN水平检测大鼠再灌注24h后，内眦静脉取血法取血约6ml，用肝素钠注射液(12500U：2ml)润管做抗凝处理。3000r/min离心15min，取上清，分别应用微板法和脲酶法，按照试剂盒要求使用酶标仪中Gen5 CHS3.04软件测定血清Scr和BUN水平，水平越高，说明肾功能损伤越严重。
1.2.4 血清SOD和MDA水平检测采用上述相似步骤，分别应用TBA法和可见分光光度法，按照试剂盒要求测定血清SOD和MDA水平，MDA水平反应机体过氧化程度，SOD水平反应机体抗氧化程度，两者可以反映机体的氧化应激情况。
1.3 统计学方法所有统计数据均由Graphpad prism 8.0软件进行分析和检验，实验数据使用±s的形式表示，计量资料符合正态分布，组间比较采用方差分析，两两比较采用Bonferroni校正t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组大鼠肾脏病理形态学 2.1.1 肾组织病理学control组大鼠未见肾小球系膜机制扩张，肾小管可见管腔侧绒毛结构，肾小球和血管附近未见炎性细胞浸润和聚集，肾实质细胞完整，与上皮界限清晰。model组大鼠肾小球皱缩，靠近血管的肾小管细胞出现空泡，细胞界限模糊，失去绒毛结构，细胞质浓缩，尚可见游离于组织间隙的炎性细胞聚集和浸润。较远处肾小管可见肾小管细胞质明显水肿，未发展出空泡病变。DHQ组大鼠可见肾小球形状较贴合，有皱缩和肿胀现象，整体较为完整。有少量炎性细胞聚集，散在分布。血管附近肾小管可见明显水肿，未出现空泡，肾小管管腔侧绒毛结构不明显，少数肾小管细胞质皱缩。见图 1。
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图 1 各组大鼠肾脏HE染色(100×、400×) |
使用Image Pro Plus测得400×放大倍数下各组大鼠切片肾小球面积与肾小球基底膜内面积及其面积比，model组较control组面积比升高约12%，DHQ组较model组面积下降约7%，说明肾小球系膜基质扩张程度减轻，可作为组织损伤的辅助判断依据。提示DHQ对肾缺血-再灌注导致的组织损伤有明显的保护效果。见图 2。
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图 2 肾小球与肾小囊面积比 注：*P < 0.05 vs control组，**P < 0.05 vs model组。 |
Scr和BUN是经典的AKI诊断标志物[10]，Scr和BUN的升高往往预示着AKI的发生。model组Scr和BUN分别较control组升高约54%和260%，说明model组大鼠出现明显肾损伤，肾缺血-再灌注损伤模型制作完成。DHQ组大鼠血清Scr和BUN分别较模型组降低约25%和50%，表现出DHQ在肾缺血-再灌注损伤模型中的良好保护作用。model组与DHQ组大鼠血清Scr和BUN水平差绝对值超过DHQ组与control组大鼠血清Scr和BUN水平差绝对值的50%，说明DHQ能较大幅度降低肾损伤大鼠血清中Scr和BUN的水平。与control组相比，model组血清BUN和Scr水平明显升高(t=6.06，P < 0.001；t=11.16, P < 0.001)，与model组相比，DHQ组血清BUN水平明显降低(t=6.903，P < 0.001)，Scr水平也显著降低(t=6.612, P < 0.001)。见图 3。
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图 3 各组大鼠血清Scr和BUN水平 注：*P < 0.05 vs control组，**P < 0.05 vs model组 |
与control组相比，model组血清SOD水平明显降低(t=8.663, P < 0.001)，MDA水平明显增高(t=5.985, P < 0.001)。与model组相比，DHQ组血清SOD水平明显升高(t=10.66, P < 0.001)，血清MDA水平明显降低(t=5.11, P < 0.001)。提示DHQ有明显的抗氧化作用。见图 4。
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图 4 各组大鼠血清MDA和SOD水平 注：*P < 0.05 vs control组，**P < 0.05 vs model组 |
肾缺血-再灌注是临床肾移植手术后常见并发症[11]。因此，寻求安全有效的治疗药物具有重要意义。本文结果显示，DHQ能明显减轻肾缺血-再灌注的组织损伤，并且减轻血清中氧化应激指标，提示DHQ对肾缺血-再灌注损伤大鼠具有确切的保护作用。
肾缺血-再灌注损伤与氧化应激有关，在本研究中，DHQ能明显提高血清SOD水平，降低MDA水平，提示DHQ具有明显的抗氧化作用。DHQ可以显著减轻尿微量白蛋白排泄增加、高血糖和脂质代谢紊乱，并减轻肾脏组织病理学损害，提示DHQ对肾脏具有直接的保护作用[12]。DHQ可以通过Nrf2信号通路降低氧化应激和Smad3的磷酸化，对单侧输尿管梗阻诱导的肾纤维化具有显著的预防和治疗作用，并抑制成纤维细胞活化[13]。提示DHQ可能以氧化应激通路为靶点对肾损伤有治疗作用。另有研究表明，DHQ可以通过PI3K/Akt[14]、JAK2/STAT3[15]、AMPK/Nrf2/HO-1[16]、NF-κB[17]等与炎症、氧化应激有关的信号通路来对相关疾病起到预防和治疗作用。因此，DHQ的抗炎作用可能来源于抗氧化作用，拮抗过氧化物因子损伤生物膜系统，阻断内源性炎性因子激活炎症反应，也可能同时拮抗氧化应激和调节炎症反应激活的关键酶，减轻组织损伤。
综上所述，本研究通过血液学检测和组织病理切片技术，初步证明了DHQ在大鼠肾缺血-再灌注损伤中的抗氧化和抗炎的药理作用，并验证了其在肾脏的炎症反应和肾小管、肾小球的过氧化损伤中的保护作用。未来对肾缺血-再灌注损伤的治疗方法探究，可以致力于研究DHQ抗氧化、抗炎和抗细胞凋亡等的信号通路，研究细胞间信息传递网络，进而为DHQ治疗肾缺血-再灌注损伤的机制做更为深入的研究。
利益冲突：所有作者均申明不存在利益冲突。
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