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  济宁医学院学报  2022, Vol. 45 Issue (4): 234-238  DOI:10.3969/j.issn.1000-9760.2022.04.002
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窦姗姗, 高丽颖, 林馨怡, 孟尧, 董康, 程葆华. Apelin-36对鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞凋亡及线粒体功能的影响[J]. 济宁医学院学报, 2022, 45(4): 234-238. DOI: 10.3969/j.issn.1000-9760.2022.04.002.
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DOU Shanshan, GAO Liying, LIN Xinyi, MENG Yao, DONG Kang, CHENG Baohua. Effects of apelin-36 on the apoptosis and mitochondrial dysfunction of SH-SY5Y cells induced by rotenone[J]. Journal Of Jining Medical University, 2022, 45(4): 234-238. DOI: 10.3969/j.issn.1000-9760.2022.04.002.
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基金项目

济宁医学院教师扶持基金(JYFC2018KJ003);大学生创新训练项目(CX2019205)

通信作者

程葆华, E-mail: chengbh1979@163.com;

文章历史

收稿日期:2022-05-11
Apelin-36对鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞凋亡及线粒体功能的影响
窦姗姗 , 高丽颖 , 林馨怡 , 孟尧 , 董康 , 程葆华     
济宁医学院基础医学院, 济宁 272067
摘要目的 探讨apelin-36对鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞凋亡及线粒体功能的影响。方法 培养SH-SY5Y细胞, 随机分为对照组、apelin-36组、鱼藤酮组和apelin-36+鱼藤酮组。通过鱼藤酮处理SH-SY5Y细胞建立帕金森病(Parkinson's disease, PD)体外模型, 在给予apelin-36预处理后, 通过CCK-8观察细胞活力, Hoechst 33342检测细胞凋亡, Western blotting检测Bax、bcl-2、α-synuclein的表达, 试剂盒检测线粒体复合物Ⅰ (complex Ⅰ)的表达和ADP/ATP的比值来观察线粒体功能。结果 与对照组相比, 鱼藤酮组细胞活力下降, 细胞凋亡增加, α-synuclein的表达增加, bcl-2/Bax比值下降, complex Ⅰ表达降低, ADP/ATP比率升高(均P < 0.05);而给予apelin-36预处理后, 与鱼藤酮组相比, apelin-36+鱼藤酮组细胞活力上升, 细胞凋亡降低, α-synuclein的表达减少, bcl-2/Bax比值增高, complex Ⅰ表达升高, ADP/ATP比率降低(均P < 0.05)。结论 Apelin-36对鱼藤酮引起的SH-SY5Y细胞凋亡具有抑制作用, 可减轻鱼藤酮所致的SH-SY5Y细胞线粒体功能紊乱, 起到神经保护作用。
关键词Apelin-36    鱼藤酮    帕金森病    线粒体损伤    凋亡    
Effects of apelin-36 on the apoptosis and mitochondrial dysfunction of SH-SY5Y cells induced by rotenone
DOU Shanshan , GAO Liying , LIN Xinyi , MENG Yao , DONG Kang , CHENG Baohua     
College of Basic Medicine, Jining Medical University, Jining 272067, China
Abstract: Objective To investigate the effects of apelin-36 on rotenone-induced apoptosis and mitochondrial dysfunction of SH-SY5Y cells. Methods SH-SY5Y cells were cultured and randomly divided into control group, apelin-36 group, rotenone group and apelin-36 + rotenone group.The vitro model of Parkinson's disease (PD) was established by treating SH-SY5Y cells with rotenone.After apelin-36 pretreatment, the cell viability was measured by CCK-8 assay.The apoptosis was measured by Hoechst 33342 staining.The expression of Bax, bcl-2 and α-synuclein was measured by western blotting.Mitochondrial function was detected by complex Ⅰ and ADP/ATP ratio. Results Compared with the control group, the cell viability was decreased and apoptosis was increased in rotenone group.And α-synuclein expression was increased significantly in SH-SY5Y cells with rotenone treatment.Bcl-2/Bax ratio was decreased due to rotenone exposure.Complex Ⅰ expression was decreased and ADP/ATP ratio was increased after rotenone treatment in SH-SY5Y cells.However, apelin-36 pretreatment significantly inhibited rotenone neurotoxicity including increasing cell viability and decreasing apoptosis of SH-SY5Y cells.Compared with rotenone group, α-synuclein expression was decreased and bcl-2/Bax ratio was increased significantly.And complex Ⅰ expression was increased and ADP/ATP ratio was decreased significantly due to apelin-36 prereatment. Conclusion Apelin-36 inhibited rotenone-induced the apoptosis of SH-SY5Y cells and alleviated rotenone-induced mitochondrial dysfunction, which played a neuroprotective role against rotenone neurotoxicity.
Keywords: Apelin-36    Rotenone    Parkinson's disease    Mitochondrial damage    Apoptosis    

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见的仅次于阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的神经退行性疾病[1],其主要病理特征是黑质致密部多巴胺能神经元发生退行性变,并伴有路易氏小体(Lewy body,LB) 出现。LB主要是由于α-突触核蛋白(α-synuclein)的异常积累形成的[2]。PD的发病机制还不清楚,而线粒体功能障碍与PD发病机制密切相关[3-4]

鱼藤酮(rotenone)是一种细胞毒性物质,可选择性地抑制细胞呼吸链NADH脱氢酶(即复合物Ⅰ,complex Ⅰ)的活性,使NADH氧化为NAD的过程受阻,减少ATP生成,阻碍质子传递,细胞中活性氧的含量进而增加,导致自由基过量累积,从而促进细胞凋亡[5-6]

Apelin最初是从牛胃组织中分离出来的。Apelin-13、apelin-17和apelin-36是apelin前体肽经水解生成的生物活性形式。越来越多的证据表明,apelin可能在PD模型中具有神经保护作用[7-8]

本实验用鱼藤酮刺激SH-SY5Y细胞,制作PD体外模型,然后用apelin-36干预,研究apelin-36的神经保护作用及对线粒体功能的影响。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试剂

人神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y细胞)购自美国菌种保藏中心(ATCC);DMEM培养液(美国Hyclone公司);鱼藤酮(美国Sigma公司);Apelin-36(美国Phoenix Pharmaceuticals公司);CCK-8(日本Dojindo公司);Hoechst 33342检测试剂盒(日本Dojindo公司);线粒体复合物Ⅰ(complex Ⅰ) ELISA试剂盒(酶免), ADP/ATP比率检测试剂盒(日本Dojindo公司);RIPA裂解液(碧云天公司);BCA蛋白浓度测定试剂盒(天根生物公司);超敏ECL化学发光试剂盒(万类生物公司);α-synuclein抗体、bcl-2抗体、Bax抗体(美国Cell Signaling Technology公司);β-actin抗体(北京中杉金桥有限公司)。

1.1.2 仪器

微量移液器(德国Eppendorf公司);CO2培养箱(美国Thermo公司);台式低温高速离心机(美国Beckman公司);超声波细胞粉碎仪(江苏波场智能科技股份有限公司);普通光学显微镜、倒置生物显微镜(日本Olympus公司);酶标仪、电泳仪、转膜仪(美国Bio-Rad公司);激光共聚焦扫描显微镜(SP8)(德国Leica公司)。

1.2 方法 1.2.1 细胞培养

SH-SY5Y细胞培养于DMEM培养基中,内含10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)和链霉素(100 U/ml)。将SH-SY5Y细胞接种于96、12或6孔板在37℃、5%CO2培养箱中培养,细胞生长至约90%后,后续根据需要加入鱼藤酮和apelin-36。

1.2.2 药物处理及分组

取对数生长期的SH-SY5Y细胞,以5×104/孔的密度接种于96、12或6孔板中,随机分成4组:对照组、apelin-36组、鱼藤酮组、apelin-36+鱼藤酮组,置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养,待细胞长至约90%,apelin-36组、apelin-36+鱼藤酮组先给予apelin-36(10-6M)预处理,其他两组加入相同剂量的PBS,鱼藤酮组、apelin-36+鱼藤酮组2h后给予鱼藤酮(500 μM)处理,其他两组加入相同剂量PBS,放入培养箱培养24h,然后进行后续实验。

1.2.3 细胞活力测定

用CCK-8法测定细胞活力。首先将SH-SY5Y细胞以5×104/孔的密度接种在96孔培养板中,细胞长至约90%,按上述方法进行药物处理。继续培养约22h后,加入CCK-8溶液(10μl/孔),避光继续孵育2h。最后在酶标仪450nm处测量吸光度值。每组设6个复孔,实验平行重复3次。

1.2.4 细胞凋亡检测

将SH-SY5Y细胞以5×104/孔的密度接种于12孔板的盖玻片上,细胞长至约90%,后按上述方法药物处理。继续培养约22h后,用PBS冲洗细胞,用4%多聚甲醛固定20min,然后用PBS清洗3次。随后,加入5mg/ml的Hoechst 33342,避光在室温下放置15min,再用PBS冲洗两次。染色细胞在倒置荧光显微镜下成像。每组选择3张照片,计数凋亡细胞数。

1.2.5 线粒体复合物-Ⅰ(complex Ⅰ)检测

SH-SY5Y细胞以5×104/孔的密度接种在6孔培养板中。细胞长至约90%,然后按上述方法进行药物处理。继续培养约22h后,去除上清液,按照人Complex Ⅰ ELISA试剂盒的说明进行操作。

1.2.6 ADP/ATP比率检测

SH-SY5Y细胞以5×104/孔的密度接种在白色96孔培养板中。细胞长至约90%,后按上述方法药物处理。继续培养约22h后,按照ADP/ATP比率检测试剂盒说明操作。

1.2.7 相关蛋白表达检测

Western blotting用于检测Bax、bcl-2、α-synuclein的表达,β-actin作为对照。方法如下:按上述方法处理细胞,然后将SH-SY5Y细胞中提取的等量蛋白质(30μg)加载到10% SDS-PAGE上,随后转移到PVDF膜上。在室温下,用含5%无脂奶粉的TBST(含1%吐温20的TBS缓冲液)封闭膜1h,然后在4℃与一抗孵育过夜。然后用TBST清膜3次,在室温下与二抗(1:5000)孵育1h。最后加入ECL溶液,暗室内曝光显影。实验平行重复3次,用ImageJ软件分析目标条带的灰度值。

1.3 统计学方法

该实验中的数据使用GraphPad Prism 5.0软件分析,计量资料以x±s表示,组间比较采用方差分析方法进行, 组间两两比较用Bonferroni检验, P < 0.05具有统计学意义。

2 结果 2.1 Apelin-36对鱼藤酮处理的SH-SY5Y细胞活力的影响

鱼藤酮(500μM)降低了SH-SY5Y细胞存活率,而apelin-36(10-6M)预处理减轻了鱼藤酮的神经毒性并提高细胞活力。表明apelin-36对鱼藤酮诱导损伤的SH-SY5Y细胞存在一定的保护作用。见图 1

图 1 Apelin-36对鱼藤酮刺激的SH-SY5Y细胞活力的影响 注:***P < 0.001 vs.对照组;###P < 0.001 vs.鱼藤酮组
2.2 Apelin-36对鱼藤酮处理的SH-SY5Y细胞凋亡的影响

Hoechst 33342染色结果(图 2A)显示,与鱼藤酮组相比,apelin-36减轻了鱼藤酮引起的细胞凋亡,并显著降低了细胞凋亡率(图 2B)。

图 2 Apelin-36对鱼藤酮刺激的SH-SY5Y细胞凋亡的影响 注:***P < 0.001 vs.对照组;###P < 0.001 vs.鱼藤酮组。
2.3 Apelin-36对鱼藤酮诱导损伤的SH-SY5Y细胞中bcl-2、Bax和α-synuclein表达的影响

与对照组相比较,鱼藤酮组bcl-2的表达显著降低,Bax的表达显著增加;而apelin-36+鱼藤酮组与鱼藤酮组相比,apelin-36则明显上调了bcl-2的表达,减少了Bax的表达(图 3A)。鱼藤酮组bcl-2/Bax的比值与对照组相比明显降低,而apelin-36+鱼藤酮组与鱼藤酮组相比,bcl-2/Bax的比值明显升高,说明apelin-36减轻了鱼藤酮造成的细胞凋亡(图 3B)。与对照组相比,鱼藤酮组α-synuclein的表达显著增加,而apelin-36+鱼藤酮组与鱼藤酮组相比,apelin-36明显减少了α-synuclein的表达(图 3C3D)。

图 3 Apelin-36对鱼藤酮刺激的SH-SY5Y细胞中bcl-2、Bax和α-synuclein表达的影响 注:**P < 0.01 vs.对照组;#P < 0.05 vs.鱼藤酮组;##P < 0.01 vs.鱼藤酮组
2.4 Apelin-36对鱼藤酮诱导损伤的SH-SY5Y细胞中complex Ⅰ和ADP/ATP的影响

与对照组相比,鱼藤酮组complex Ⅰ的表达下调,ADP/ATP比率显著上调;而与鱼藤酮组相比,apelin-36和鱼藤酮共处理组逆转了这种现象。见图 4

图 4 Apelin-36对鱼藤酮诱导损伤的SH-SY5Y细胞中complex Ⅰ和ADP/ATP的影响 注:***P < 0.001 vs对照组;###P < 0.001 vs鱼藤酮组;##P < 0.01 vs鱼藤酮组
3 讨论

线粒体是有氧呼吸发生的主要场所,除了为细胞提供能量外,线粒体还参与了细胞信息传递、细胞分化、和细胞凋亡等过程,而且拥有调控细胞生长和细胞周期的能力[9]。研究显示错误折叠的α-synulein的过度累积导致了神经退行性变,而线粒体功能障碍参与了错误折叠的α-synulein累积这一过程[10-11]

鱼藤酮是一种可直接透过细胞膜和血脑屏障的细胞毒性物质。线粒体complex Ⅰ可被鱼藤酮选择性地阻断,从而使NADH的氧化过程受阻,ATP生成减少,细胞中活性氧族增加,进而自由基增加,进一步导致氧化应激[12],最终引起细胞凋亡。因此鱼藤酮可导致细胞线粒体功能障碍,引起细胞凋亡。在本实验中,与对照组相比,鱼藤酮组α-synulein表达明显升高,bcl-2/Bax比值明显降低,细胞活力明显降低,细胞凋亡显著增多。Bcl-2家族蛋白是典型的凋亡相关蛋白,可操控线粒体的外膜通透性。促凋亡蛋白Bax可与抗凋亡蛋白bcl-2结合形成调节细胞凋亡的异二聚体,当细胞发生凋亡时,bcl-2/Bax比率降低[13]。与鱼藤酮组相比,apelin-36和鱼藤酮共处理组中α-synulein的表达明显降低,说明apelin-36预处理可减少错误折叠的α-synulein累积;同时,apelin-36和鱼藤酮共处理组中bcl-2/Bax比率明显升高,细胞活力显著升高,细胞凋亡则明显减少,说明apelin-36预处理可减少细胞凋亡,因此apelin-36可减轻鱼藤酮对SH-SY5Y细胞的神经毒性作用,对神经细胞起到保护作用。

鱼藤酮通过阻断complex Ⅰ造成了ATP生成减少,而ATP的生成减少降低了线粒体膜电位(ΔΨm),导致线粒体膜的通透性改变,引起了线粒体功能紊乱[14-15]。本研究首次在鱼藤酮PD体外模型中通过检测线粒体complex Ⅰ的表达和ADP/ATP的比率,来讨论apelin-36是否可以减轻鱼藤酮造成的线粒体功能紊乱。与对照组相比,鱼藤酮组complex Ⅰ的表达明显降低,而ADP/ATP的比率显著升高,这说明鱼藤酮造成了线粒体功能紊乱。与鱼藤酮组相比,apelin-36和鱼藤酮共处理组complex Ⅰ的表达明显升高,而ADP/ATP的比率显著降低,说明apelin-36可以减轻鱼藤酮造成的线粒体功能紊乱。

综上所述,apelin-36可以减轻鱼藤酮造成的线粒体功能紊乱,减少错误折叠的α-synulein累积,提高细胞活力,减少细胞凋亡,起到神经保护作用。而apelin-36通过何种信号传导途径减轻鱼藤酮造成的线粒体功能紊乱还不清楚,值得进一步研究,为apelin成为治疗PD的潜在临床药物提供新的证据。

利益冲突:所有作者均申明不存在利益冲突。

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