无创产前基因检测(noninvasive prenatal testing，NIPT)是通过采集孕妇外周血(5ml)，提取游离DNA，采用新一代高通量测序技术，结合生物信息分析，得出胎儿患染色体非整倍性疾病(21三体又称唐氏综合征，18三体，13三体)风险率的技术。此技术最早是1997年香港中文大学卢煜明教授在怀有男性胎儿的孕妇外周血中扩增到了Y染色体的片段，正常女性体内不含有Y染色体，从而证明了孕妇外周血中存在胎儿游离DNA，开启了探索NIPT新技术的思路^[1]。NIPT技术以安全、简单、实用等特点在临床得到广泛应用。NIPT临床应用指征和阳性预测值评价尚不完善。本文通过本中心的研究数据，对NIPT阳性预测值和假阳性等进行比较分析，从而探讨NIPT在胎儿染色体非整倍体的诊断中应用价值，为该技术在产前诊断中的合理应用提供良好的临床依据。

1 资料与方法 1.1 一般资料

本中心收集2016年1月-2019年12月在济宁市第一人民医院行NIPT孕妇共8828例，其中高龄孕妇选择NIPT 4200例，血清学筛查高风险643例，血清学筛查临界风险2200例，超声软指标异常338例，双胎/IVF-ET 634例，错过唐筛选择NIPT替代108例，拒绝唐筛要求NIPT 610例，其他95例。见表 1。本研究获本院伦理委员会批准。

1.2 方法 1.2.1 试剂和仪器

无创DNA的试剂盒采用贝瑞和康试剂盒，采用贝瑞和康NextSep CN500测序平台。羊水穿刺采用Thermo培养箱，芯片采用Human CytoSNP-12芯片。羊水培养基采用白云山细胞培养基。

1.2.2 NIPT检测

抽取孕妇外周血5ml用EDTA抗凝，提取血浆游离DNA，采用NextSep CN500高通量测序仪检测，结果进行高通量分析，并通过生物信息学分析计算Z值，正常值为Z值介于-3~3之间，当Z值＞3，三体高风险，当Z值＜-3，单体高风险。NIPT高风险孕妇行羊水穿刺验证结果，判断有无假阳性。NIPT低风险孕妇进行产前、产后电话追踪随访，判断有无假阴性。

1) 核型染色体制备。受检者妊娠孕周均在18~32周，B超定位经腹部羊水穿刺取样，每次取羊水量20~30ml，将新鲜羊水移入20ml离心管，室温，1700~1800r/min离心10min，吸去上清液，留约0.5ml，分别接种于两个培养瓶中，采用G显带法，进行羊水细胞染色体核型分析。

2) 基因芯片技术。采集羊水10ml并提取gDNA(QIAGEN)。扩增产物DNA取4μl进行第2轮扩增，两轮扩增后的产物继续按照说明书(Infinium@HD Assay Super，Manual Protoc01)操作，经过一系列的酶终止，变性后与Human CytoSNP-12芯片(Illumina，美国)杂交，再经过染色、信号放大后进行芯片扫描，用Karyostudio(version1.4.3 Illumina)软件进行数据分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS15.0统计软件进行统计分析，计数资料用n表示。NIPT高风险结果与羊水穿刺结果进行比对，统计阳性和假阳性例数。

2 结果 2.1 2016-2019年NIPT高风险结果与羊水穿刺结果分析

2016-2019年NIPT高风险123例，其中21三体高风险38例、18三体高风险12例、13三体高风险5例、性染色体高风险和其他染色体高风险56例和12例。通过羊水穿刺介入性产前诊断确诊21三体28例，假阳性例数10例；18三体7例，假阳性例数5例；13三体1例，假阳性例数1例；性染色体异常17例，假阳性例数39例；其他染色体异常4例，假阳性例数8例。阳性预测值分别为73.7%、58.3%、20.0%、30.4%、33.3%。见表 2、3。

2.3 随访结果

所有NIPT孕妇进行电话随访。NIPT高风险孕妇123例，行羊水穿刺104例，确诊染色体异常57例，其中引产55例，1例胎儿性染色体47(XYY)，羊水穿刺确诊后，要求继续妊娠，分娩后随访新生儿出生后6个月未发现异常；1例胎儿性染色体47(XXY)，羊水穿刺确诊后，要求继续妊娠，分娩后随访新生儿出生后6个月未发现异常。未行羊水穿刺19例，4例21三体高风险胎儿超声异常引产；2例18三体高风险，超声胎儿多发畸形引产；1例13三体高风险，超声NT 4.0mm引产；4例性染色体高风险拒绝羊水穿刺分娩后随访新生儿正常；有8例失访病历。NIPT低风险孕妇行电话随访未发现新生儿发育异常。

3 讨论

我国出生缺陷发生率高达5.6%^[2]，国家推行出生缺陷三级预防策略中，产前诊断是降低出生缺陷率重要的二级预防。侵入性产前诊断可导致流产、胎膜早破、感染等并发症，传统的产前诊断技术如羊水穿刺等，约0.5%~0.86%胎儿丢失率^[3]。因此外周血NIPT以无创性和相对较高的准确性在临床上获得了较广泛的应用。

在NIPT检测技术的临床评价中，包含两方面：一是NIPT选择的临床应用指征，是否适用；二、NIPT的阳性预测值、假阳性和假阴性结果的比较。通过对NIPT的临床应用指征统计数据分析，临床中选择做NIPT的孕妇以高龄孕妇为主(4200/8828)。国家卫计委发布的《高通量基因测序产前筛查与诊断技术规范(试行)》，指出高龄(≥35岁)为NIPT的慎用人群。高龄孕妇选择做NIPT的比例最高，一方面是我国国情所致，2016年二胎政策放开后大量的高龄孕产妇的出现^[4]，使得高龄孕妇占妊娠总数的比例明显增高。另一方面，高龄孕妇对侵入性产前诊断流产、感染等风险接受较差。一项大型病例队列研究发现≥35岁孕产妇在人群中的自然流产率≥25%^[5]。从既往地统计学数据显示，高龄孕妇引起胎儿染色体疾病的比例显著增加。以最常见的唐氏综合征为例，发生率约为妊娠的1/500与出生儿的1/(800~1000)，而在35岁以上的高龄孕妇，唐氏综合征的发生率增加至1/(200~270)^[5]，所以在临床咨询中一定要注意NIPT和侵入性产前诊断的指征选择，尤其是高龄孕妇。对于21、18和13三体综合征产前筛查来说，NIPT是目前最敏感的检测技术手段^[6]。但是我们也要有一个明确的认识，NIPT只能算一个深度筛查技术，并不是传统意义上诊断的“金标准”，故NIPT的慎用人群首选侵入性产前诊断，且NIPT高风险人群需要进一步侵入性产前诊断如羊水穿刺进行确诊^[2]。

通过表 2、表 3的统计数据可以对NIPT高风险阳性预测值、假阳性结果进行评价。2016-2019年NIPT共发现非整倍体及其他染色体高风险病例123例，其中21三体38例，18三体12例，13三体5例，性染色体56例，21三体的阳性预测值为73.7%(28/38)，18三体的阳性预测值为58.3%(7/12)，13三体的阳性预测值为20.0%(1/5)，性染色体的阳性预测值为30.4%(17/56)，其中以21三体的阳性预测值最高，13三体的阳性预测值最低，检测技术中每个染色体异常均存在假阳性例数。根据文献报道，NIPT对于21三体的检出率为94.4%~100%，平均99.7%^[7]，本文21三体阳性预测值为73.7%，数值偏低可能由于部分高风险孕妇，因为超声异常直接选择了引产术，而未行羊水穿刺进一步确诊。13三体阳性预测值最低，有研究表明可能是由于13号染色体的鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸和胞嘧啶脱氧核糖核苷酸含量较低，导致测序时出现误差，或由于13三体孕妇的胎盘较小，释放入母血的游离胎儿DNA数量相对减少造成的^[8]。对于NIPT低风险病人，虽然没有羊水穿刺进一步确诊，但是我院通过分娩后随访未发现假阴性结果。

综上所述，孕妇外周血无创产前基因检测技术虽然无创，但是也存在假阳性及假阴性结果^[9-10]，所以NIPT高风险孕妇需要进行侵入性产前诊断。NIPT低风险，仅仅说明胎儿罹患21、18、13三体综合征的风险较低，并不能说明其他染色体异常的风险也较低，同时也不除外出现假阴性结果的可能性。对于NIPT低风险孕妇，一定要建议定期产检，严格进行排畸超声检查。NIPT技术对21三体综合征具有较高的准确率，又因无创操作，故单纯高龄孕妇选择较多。NIPT可作为筛查手段，而对于高风险孕妇，需要临床咨询人员明确告知NIPT的利弊，仍然建议首选羊水穿刺等侵入性产前诊断技术^[11-12]。

当然，随着检测技术进一步的提高，我们期待NIPT技术更好的发展，有更宽的检测范围和更高的准确率，以降低侵入性产前诊断技术带来的风险。

利益冲突：所有作者均申明不存在利益冲突。