毒根斑鸠菊(Vernonia cumingiana Benth)为斑鸠菊属(Vermonia)，是含有1000多种植物的菊科(Compositae)大属，主要分布于福建、台湾、广东、海南、广西等地。斑鸠菊属植物中分离得到的化学成分种类较多，且含有多样生物活性，包括苯丙素类、甾体、萜类^[1-3]、黄酮类^[4]、脂肪酸等^[5]。其药理学研究表明，该属植物具有抗肿瘤^[6]、抑菌^[7]、抗炎^[8]、免疫和抗感染活性^[9-11]，目前关于其黄酮提取的报道很少。本实验采用正交试验方法从毒根斑鸠菊提取总黄酮，利用紫外分光光度法测定总黄酮的含量，为开发和利用毒根斑鸠菊资源提供了重要的理论基础。

1 仪器与材料 1.1 样品来源

本实验所用毒根斑鸠菊花枝样品于2019年1月采自于海南省昌江黎族自治县，由青岛科技大学化学与分子工程学院钟惠民教授鉴定。凭证样品保存于济宁医学院分子医学与化学实验室。

1.2 仪器与试剂

芦丁标准品(CAS：153-18-4 C₂₇H₃₀O₁₆，MW：610.52，如吉生物科技公司)；甲醇、硝酸铝、蒸馏水、无水乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠均为分析纯试剂(国药集团化学试剂有限公司)。电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；超声机(杭州萧山余祝超声波设备厂)；移液枪(美国thermo热电移液器)；紫外可见分光光度计5100UV(上海元析仪器有限公司)。

2 方法与结果 2.1 芦丁标准品制备

在50 mL容量瓶中精准称取芦丁标准品20 mg，将其溶解在甲醇中并稀释至容量瓶标线，使溶液的浓度为0.40 mg·mL^-1。

2.1.1 测定波长选择

于10 mL玻璃比色管中加入1.00 mL上述标准品溶液，再依此加入CH₃OH溶液4.00 mL 5% NaNO₂溶液0.60 mL，旋涡混合器混匀于6 min后，再加入10% Al(NO₃)₃溶液0.60 mL，旋涡混合器混匀，静置6 min，最后加入10% 氢氧化钠3.00 mL后并以CH₃OH溶液定容至刻度线，摇匀，得空白、对照品溶液，将上述溶液静置15 min后，空白不加标准品溶液，利用紫外分光光度法在400~800 nm波长范围内测定上述标准液的吸光度值A^[12]，最后确定其测定波长为510 nm。

2.1.2 芦丁标准曲线绘制

在25 mL容量瓶中，分别加入制备好的标准品溶液0.00、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL，再依此加入CH₃OH溶液4.00 mL、5% NaNO₂溶液0.60 mL，旋涡混合器混匀于6 min后，再加10% Al(NO₃)₃溶液0.60 mL，旋涡混合器混匀，静置6 min，最后加入10% 氢氧化钠3.00 mL后并以CH₃OH溶液定容至刻度线，得空白、对照品溶液，15 min后，于510 nm波长处测定吸光度值A。依照回归线方程y=6.7882x+0.0230，R²=0.9952，横坐标为芦丁浓度，纵坐标为吸光度值A，得回归曲线显示各点分布均匀一致，呈正相交。见图 1。

2.2 样品液制备及总黄酮含量的测定

精确称取0.50 g毒根斑鸠菊花枝粉末用95%乙醇10 mL溶解，采用超声波提取，将提取液过滤后并减压浓缩，用CH₃OH溶液于50 mL容量瓶对浓缩液定容。用移液枪量取0.10 mL的上述样品液，按“2.1.2”的操作方法测定吸光度值A，总黄酮含量由回归方程计算得出。

2.3 单因素试验 2.3.1 超声波功率

取10 mL 95%乙醇溶液溶解精确称取的毒根斑鸠菊花枝粉末0.50 g，分别按照60、180、300、420、540和780W的超声功率梯度进行提取30 min后，过滤并减压浓缩，用50 mL容量瓶以CH₃OH溶液定容，按照"2.1.2"项步骤测吸光度A，据回归方程计算总黄酮含量。由图 2得出，总黄酮提取含量总体表现为先升高后降低，功率为300~420 W时黄酮量变化不明显。当超声波功率达540 W时，提取的总黄酮含量最高。由此可以得出最佳超声波功率为540 W。

2.3.2 提取温度

取10.00 ml的95%乙醇溶解精确称取的毒根斑鸠菊花枝粉末0.50 g，分别在温度梯度为30 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃，超声提取30 min后，过滤并减压浓缩提取液，用50 mL容量瓶以CH₃OH溶液定容，按照"2.1.2"项步骤测取吸光度值A，结合回归方程得黄酮含量。由图 3得出，曲线在初始阶段变化不明显，当温度超过50 ℃时，逐渐递增，且增幅较大。一旦温度超过70 ℃时，总黄酮含量开始降低，可能是由于温度升高导致黄酮化学结构的破坏，从而使部分失活，由此得知当提取温度为70 ℃时，总黄酮含量可达至最大值，发挥最大效应。

2.3.3 乙醇浓度

用10 mL的乙醇溶解毒根斑鸠菊花枝粉末0.50 g，乙醇浓度梯度为10%、30%、50%、70%、90%、100%，超声提取后过滤并减压浓缩，于50 mL容量瓶中以CH₃OH溶液定容。按照“2.1.2”项步骤测取吸光度值A，由回归方程计算总黄酮含量。由图 4得出，随乙醇浓度的增大，总黄酮提取总量逐渐升高，在乙醇浓度为70%时达其高峰，随之大幅下降。因此，确定最佳提取乙醇浓度为70%。

2.3.4 料液比

精密称取毒根斑鸠菊花枝粉末0.50 g，10 mL 95%乙醇溶解, 按料液比分别为1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40和1 ∶50 g/mL，之后在超声条件下提取30 min，甲醇定容至50 mL，按照“2.1.2”项步骤测取吸光度值A，由回归方程计算总黄酮含量。由图 5得出，在初始阶段时，黄酮含量变化不明显，之后便大幅上升，达其峰值，对应料液比是1 ∶20 g/mL。峰值后的曲线呈明显的下降趋势，当料液比继续增大时，总黄酮含量却呈降低状态，说明过大的料液比并不利于总黄酮的提取。因此，选用1 ∶20 g/mL料液比为最宜。

2.3.5 提取时间

精密称取毒根斑鸠菊花枝粉末0.50 g，10 mL 95%乙醇溶解，超声下分别提取10、20、30、50和70 min后过滤并减压浓缩，用50 mL容量瓶以甲醇定容，按照“2.1.2”步骤来测取吸光度A，结合回归方程得黄酮含量。由图 6得出，有一明显单峰，对应横坐标值为70 min，黄酮含量为最大。70 min后，继续延长时间，总黄酮含量反而有所降低。因此，确定最佳提取时间为70 min。

2.4 正交试验

根据上述各因素实验所得结果，设计正交试验L₁₆(4⁵)表。对毒根斑鸠菊花枝总黄酮含量计算按照“2.1.2”的操作方法，由此来确定最佳的毒根斑鸠菊花枝总黄酮含量的提取条件。见表 1。

由表 2的5个因素4个K值大小可以得出以下结论，A种因素A₃>A₂>A₁>A₄，B种因素B₁>B₂>B₃>B₄，C种因素C₄>C₂>C₃>C₁，D种因素D₃>D₂>D₁>D₄，E种因素E₄>E₁>E₂>E₃，正交实验结果见表 2。

2.5 试验方法的考察 2.5.1 精密度试验

称1.00 mL芦丁标准品溶液共5份，按“2.1.2”项操作于λ=510 nm处测得吸光度后计算RSD值为1.29%(n=5)。

2.5.2 显色稳定试验

精密称取毒根斑鸠菊花枝样品的溶液0.10 mL到试管中后加入4.90 mL甲醇，按照“2.1.2”项的操作方法进行显色，空白对照管不加入NaNO₂的溶液，分别在0、10、20、30、40 min测1次吸光度值，做5次平行实验后计算毒根斑鸠菊花枝中总黄酮含量，经过计算得到的RSD值为1.67%(n=5)。

2.5.3 方法重现性试验

称5份5.00g花枝粉末根据最佳提取条件提取总黄酮，过滤、减压浓缩，在100 mL容量瓶中加入斑鸠菊花枝浓缩液并用甲醇定容。将0.10 mL的花枝提取液置于比色管并用甲醇定容至5 mL，按“2.1.2”项方法显色并测定其吸光度，算得RSD值为0.97%(n=5)。

2.5.4 回收率试验

称5.00 g毒根斑鸠菊花枝5份，于最佳提取条件下进行提取总黄酮，按“2.1.2”项操作显色并于λ=510 nm处测吸光度后计算RSD值为0.96%(n=5)，加样回收率为99.10%。

2.5.5 试验方法结果

根据芦丁标准曲线方程可知，在浓度为0.005~0.070 mg·mL^-1时，其质量浓度与吸光度之间呈良好的线性关系；稳定性、回收率、精密度和重现性试验的RSD值都小于2%，因此可以得出，此方法有良好的加样回收率、重复性稳定性与精密度；表 3所示为验证实验结果，毒根斑鸠菊花枝中总黄酮平均含量为81.59 mg·g^-1，表 3所作3次平行试验的RSD值为1.58%(n=3)，两者均比正交试验表中的值高，由此可以确定A₃B₁C₄D₃E₄为最佳提取工艺条件。

3 结论

正交试验是一种科学便利的实验方法，有快速、高效率、经济、简单易行的特点，多因素综合结果可由其直接得出，无论单味药^[13]还是组方药^[14]，提取工艺试验都可通过正交试验验证。本研究通过正交试验法优化了毒根斑鸠菊花枝总黄酮的提取工艺，并进行了3次平行试验进行验证得到最佳提取条件为：超声波功率540 W、温度70 ℃、乙醇70%、料液比1 ∶20g/mL、提取时间70 min为最佳提取条件。此时参数组合为A₃B₁C₄D₃E₄。得到的毒根斑鸠菊花枝中总黄酮含量为81.59 mg·g^-1。综上所述，影响毒根斑鸠菊花枝总黄酮提取因素排列为：提取时间>料液比>乙醇浓度>超声波功率>提取温度。该实验工艺简单、成本低、稳定可行、重复性好、提取效率较高，具有良好的应用前景，为毒根斑鸠菊进一步科学研究和开发新的天然抗氧化剂和保鲜剂提供了理论基础。

利益冲突：所有作者均申明不存在利益冲突。