膀胱癌是世界常见的恶性肿瘤之一，全球每年发病约100万，居世界第9位[1]。膀胱尿路上皮癌是膀胱癌最主要的病理类型，约占90%；目前，外科手术是膀胱癌最主要的治疗手段，70%~80%的非肌层浸润性膀胱癌预后良好，但有部分患者预后并不理想[2]。非编码RNA在膀胱癌中的意义已逐渐引起重视[3-5]。长链非编码RNA(Long non-code RNA, lncRNA)MIR4435-2HG又称AGD2、MORRBID、LINC00978和lncRNA-AWPPH，在肝癌和肺癌等多种肿瘤中异常高表达，且与患者预后不良密切相关[6-7]；然而，未见关于MIR4435-2HG和膀胱尿路上皮癌患者预后关系的报道。有研究指出，MIR4435-2HG可通过靶向下调miR-128-3p表达在卵巢癌中发挥促癌作用[8]，且miR-128-3p已被证实可抑制膀胱癌细胞的侵袭、迁移和上皮间质转化[9]。因此，本研究通过检测MIR4435-2HG和miR-128-3p在膀胱尿路上皮癌中的表达情况，分析两者对患者预后的影响，旨在为膀胱尿路上皮癌临床诊断和预后评估提供新线索。
1 资料与方法 1.1 一般资料收集2017年8月-2019年10月于郑州人民医院泌尿外科行膀胱癌切除术的膀胱尿路上皮癌患者87例，其中男51例，女36例，年龄38~72岁，平均年龄(56.97±7.21)岁。纳入标准：1)经组织病理学检查确诊为膀胱尿路上皮癌；2)术前未接受任何放疗、化疗和靶向治疗等。排除标准：1)患有心血管疾病、肝脏系统疾病和合并其他肿瘤者；2)有远端转移的患者；3)有全身性感染者。手术获取患者肿瘤组织样本和距肿物边缘＞1 cm的正常膀胱黏膜组织(癌旁组织，镜下未见癌细胞)样本，置入冻存管后于液氮中保存。患者术后均接受随访，随访截止2020年10月，随访时间12~36个月，平均21.5个月。本研究经郑州人民医院伦理委员会批准同意，且所有参与者均签署了知情同意书。
1.2 方法实时荧光定量PCR检测MIR4435-2HG和miR-128-3p表达。将冻存的肿瘤组织和癌旁组织研磨粉碎后，加入Trizol试剂(美国Invitrogen公司)提取总RNA后，参照逆转录试剂盒(大连宝生物工程有限公司)说明书将RNA进行反转录；以产物cDNA为模板，分别参照lnRcute LncRNA和miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(北京天根生化科技有限公司)说明书分别以GAPDH和U6为内参采用2-△△Ct法检测MIR4435-2HG和miR-128-3p表达水平。其中，实验所需引物(上海生工生物工程股份有限公司合成)如下：MIR4435-2HG正向引物为5’-GACATTCCAGACAAGCGGTG-3’，反向引物为5’-TCCACTTTGCTTGTCAGGGA-3’；miR-128-3p正向引物为5’-GGTCACAGTGAACCGGTC-3’，反向引物为5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；GAPDH正向引物为5’-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3’，反向引物为5’-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3’；U6正向引物为5’-CTCGCTTCGGCAGCACAT-3’，反向引物为5’-TTTGCGTGTCATCCTTGCG-3’。
1.3 统计学方法采用SPSS19.0软件进行统计学分析，计量资料以s±s表示，采用t检验进行比较；计数资料以%表示，采用χ2检验分析；采用Pearson相关分析膀胱尿路上皮癌组织中MIR4435-2HG与miR-128-3p表达相关性; Kaplan-Meier法分析随访患者的生存情况，比较采用Log-rank检验；采用COX回归进行膀胱尿路上皮癌患者预后的单因素和多因素分析。P＜0.05时表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 MIR4435-2HG和miR-128-3p在膀胱尿路上皮癌组织中的表达膀胱尿路上皮癌组织中MIR4435-2HG表达水平(4.57±1.03)明显高于癌旁组织(2.43±0.96)(t=14.176，P＜0.05)，而膀胱尿路上皮癌组织miR-128-3p表达水平(0.38±0.03)明显低于癌旁组织(0.57±0.08)(t=20.742，P＜0.05)。
2.2 MIR4435-2HG和miR-128-3p表达与膀胱尿路上皮癌患者临床病理特征的关系以膀胱尿路上皮癌组织中MIR4435-2HG和miR-128-3p表达水平的平均值为界限，分别将87例患者分为MIR4435-2HG高表达组(44例)、MIR4435-2HG低表达组(43例)和miR-128-3p高表达组(39例)、miR-128-3p低表达组(48例)。MIR4435-2HG低表达组和MIR4435-2HG高表达组患者在病理分级、临床分期和淋巴结转移方面差异有统计学意义(P＜0.05)，而miR-128-3p低表达组和miR-128-3p高表达组患者在各资料方面均无统计学差异(P>0.05)。见表 1。
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表 1 MIR4435-2HG和miR-128-3p与膀胱尿路上皮癌患者临床病理特征的关系(n/%，x±s) |
随访截止时，MIR4435-2HG高表达组患者中位生存期27个月，总生存率为36.68%，明显低于MIR4435-2HG低表达组中位生存期32个月，总生存率66.80%(χ2=9.768，P＜0.05)；而miR-128-3p高表达组患者中位生存期32个月，总生存率为68.17%，明显高于miR-128-3p低表达组中位生存期27个月，总生存率39.89%(χ2=7.574，P＜0.05)。见图 1。
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图 1 MIR4435-2HG(A)和miR-128-3p(B)表达与膀胱尿路上皮癌患者预后的关系 |
单因素COX回归分析结果显示，高病理分级、淋巴结转移、MIR4435-2HG高表达和miR-128-3p低表达是影响膀胱尿路上皮癌患者预后的危险因素(P＜0.05)；进一步多因素COX回归分析结果显示，淋巴结转移、MIR4435-2HG高表达和miR-128-3p低表达是影响膀胱尿路上皮癌患者预后的独立危险因素(P＜0.05)。见表 2和表 3。
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表 2 膀胱尿路上皮癌患者预后的单因素COX回归分析 |
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表 3 膀胱尿路上皮癌患者预后的多因素COX回归分析 |
在膀胱尿路上皮癌组织中，MIR4435-2HG与miR-128-3p表达呈负相关(r=-0.544，P＜0.05)。见图 2。
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图 2 膀胱尿路上皮癌组织中MIR4435-2HG与miR-128-3p表达的相关性 |
膀胱尿路上皮癌的发生是一种多因素、多步骤的复杂过程，与基因调控密切相关[5, 11]。非编码RNA是一类不具有编码蛋白质功能的RNA，约占人类基因组的98%，这其中包括10万多种lncRNA和约2500种miRNA[12]。越来越多的证据显示，在肿瘤中存在着异常表达的lncRNA和miRNA，可通过调控癌细胞生物学行为发挥致癌或抑癌作用，检测其表达则有利于肿瘤的早期诊断和预后评估[13-14]。目前，临床上多依靠肿瘤分级来指导膀胱尿路上皮癌的治疗和预后，缺乏明确的分子标志物来指导临床诊疗。因此，寻找有效的膀胱尿路上皮癌诊断和预后评价的分子标志物一直是临床研究的热点。MIR4435-2HG是一种与肿瘤发生发展密切相关的lncRNA。MIR4435-2HG在结直肠癌中表达上调，其高表达水平与患者TNM分期、治疗前癌胚抗原水平和患者总生存率低相关，被认为是结直肠癌诊断和预后的潜在生物标志物[15]。MIR4435-2HG在肺癌中异常高表达，与患者组织学分级和淋巴结转移相关，且可通过与β-catenin相互作用在癌细胞增殖和侵袭过程中发挥着重要的促进作用[16]。MIR4435-2HG在肾细胞癌中发挥着重要的致癌作用，其高表达提示预后不良[17]。MIR4435-2HG在膀胱癌组织和细胞中表达上调，且可通过海绵性吸附miR-4288促进癌细胞的增殖、迁移和侵袭[18]，但其在临床上的表达意义及与患者预后的关系并不清楚。本研究发现，MIR4435-2HG在87例膀胱尿路上皮癌组织中表达异常高于癌旁组织，且其表达水平与患者病理分级、临床分期和淋巴结转移有关。这提示MIR4435-2HG可能参与膀胱尿路上皮癌的发生发展过程。另外，本研究对膀胱尿路上皮癌患者进一步随访发现，MIR4435-2HG高表达患者生存率明显低于MIR4435-2HG低表达患者，提示MIR4435-2HG与患者预后有关，MIR4435-2HG有可能成为判断膀胱尿路上皮癌预后的生物指标之一。
miR-128-3p是miRNA家族成员，在宫颈癌和肺癌等中表达下调，且可通过多种机制参与肿瘤的发病机制[19-20]。其在肝癌中也表达下调，通过PI3K/AKT通路调控细胞增殖与迁移而发挥抑癌作用，且miR-128-3p低表达患者有着较短的无病生存期，因此被认为是肝癌患者的预后标志物[21]。有研究显示，miR-128-3p在食管鳞癌中表达下调，与患者预后不良有关，且可通过靶向调控ZEB1抑制癌细胞转移[22]。现有miR-128-3p和膀胱尿路上皮癌的研究多集中在生物学功能方面[9]，其在膀胱癌临床中的意义并不清楚。本研究发现miR-128-3p在87例膀胱尿路上皮癌组织中异常低表达，提示miR-128-3p可能与膀胱癌恶性进展有关。此外，miR-128-3p低表达患者生存率较miR-128-3p高表达患者明显缩短，miR-128-3p低表达与膀胱癌患者预后不良有关。lncRNA参与调控肿瘤发生发展的作用机制十分复杂，而其与miRNA相互作用是其中重要的一方面，lncRNA可通过海绵样吸附作用竞争性结合miRNA，进而使miRNA调控基因的作用受到抑制[23]。目前，关于MIR4435-2HG的致癌作用机制的研究也多集中在其与miRNA包括miR-487a、miR-802和miR-206等的作用方面[7, 24-25]。有研究通过生物信息学软件在卵巢癌中预测发现，MIR4435-2HG可与miR-128-3p靶向结合，可通过下调miR-128-3p表达影响卵巢癌细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡而发挥促癌作用[8]。本研究进一步进行相关性分析发现，膀胱尿路上皮癌组织中MIR4435-2HG与miR-128-3p之间存在呈负相关。MIR4435-2HG可能结合miR-128-3p抑制其表达进而参与膀胱尿路上皮癌发生发展过程，但具体的调控作用及途径还有待进一步探讨。
综上所述，膀胱尿路上皮癌组织中MIR4435-2HG表达上调，而miR-128-3p表达下调，两者存在负相关且均与患者预后不良有关，MIR4435-2HG和miR-128-3p可能是膀胱尿路上皮癌早期诊断和预后评估的潜在靶分子。
利益冲突：所有作者均申明不存在利益冲突。
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