2. 日照市质量检验检测研究院, 日照 276826;
3. 济宁医学院临床医学院, 济宁 272013
2. Rizhao Institute of Quality Inspection and Testing, Rizhao 276826, China;
3. School of Clinical Medicine, Jining Medical University, Jining 272013, China
中药材藤黄主要活性成分藤黄酸(GA)具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗菌及杀虫等生物活性[1]；新藤黄酸(GNA)对多种肿瘤细胞株有抑制作用[2-3]，且可加强化疗药物对某些肿瘤细胞敏感性[4]。它们均能选择性地攻击癌细胞而对正常造血系统和白细胞影响较小，但水溶性差(1L水仅能溶解13mg GA)。目前GA、GNA的较高毒性、低水溶性、较差选择性、短半衰期等非成药性，限制了它们在抗癌领域的应用[5-6]。本实验通过从藤黄中提取分离GA和有创新性地从残余物中干柱逆流梯度层析法分离GNA，制备了N-(3-氯-4-氟苯基)藤黄酰胺、N-(3-氯-4-氟苯基)新藤黄酰胺和N-[2-(N’, N’-二甲氨基)乙基]藤黄酰胺3种新分子实体以求能改善它们的成药性。
1 材料与方法 1.1 主要试剂2-(N’, N’-二甲氨基)乙胺购自阿拉丁公司；N, N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)购自北京偶合科技有限公司；3-氯-4-氟苯胺购自AccelaChemBio.Co.Ltd；对二甲氨基吡啶(DMAP)购自武汉远成赛创科技有限公司；石油醚(b.p.60℃~90℃)购自天津市富宇精细化工有限公司；薄层层析硅胶H、硅胶GF254均购自青岛海洋化工有限公司；藤黄购自安徽亳州药材市场；硅胶GF254薄层板由本课题组铺制。
1.2 方法 1.2.1 GA提取分离[7]取10g藤黄粉末用丙酮(30mL)超声提取18min倾出上清液, 残渣加入丙酮(25mL)重复以上操作。至第4次提取后取少量丙酮溶解痕量残渣，与GA、GNA对照品溶液同板共薄层检测(TLC, 展开剂石油醚-乙醇-三乙胺-乙酸乙酯v/v 1.2 ∶0.5 ∶0.2 ∶0.3)无GA、GNA斑点。其它同胡钟操作[7]得纯GA固体，ESIMS m/z 651[M+Na+]，可直接用于本文下述反应。
1.2.2 GNA的分离1) 制备含GA、GNA粗品的硅胶拌样。滤除GA吡啶盐沉淀，主要含GA、GNA粗品的母液，制备同胡钟操作[7]。减压蒸除吡啶后的2.0g残余物0.5%盐酸调pH 3~4后乙酸乙酯提取(9mL×4)，至水层与GA、GNA对照品同板共薄层检测(展开剂石油醚-乙醇-三乙胺-乙酸乙酯v/v 1.2 ∶0.5 ∶0.2 ∶0.3)无GA、GNA斑点。合并提取液水洗(3mL×3) 分出有机层无水硫酸镁干燥1h，滤液减压浓缩后所得残余物溶于尽可能少的丙酮并加尽可能少的200目硅胶使没过液面，旋转蒸发器蒸除溶剂得粗品硅胶拌样(含60%左右的GA、GNA粗品)用于GNA的分离。
2) 逆流干柱层析法从以上硅胶拌样中分离高纯度的GNA[8]。①装柱。如专利文献[8]所示，底端不带活塞、上端非磨口的带透砂板的层析柱中依次填充适量以上拌样粗硅胶、硅胶H[硅胶高度∶内径>8 ∶1，硅胶H与待分离样品重量比(80~120) ∶1]后，关闭洗脱剂装置部分的底部活塞并水泵抽实。②柱层析。关闭抽气部分、适度打开装洗脱剂分液漏斗的底部活塞，依次以适量体积的石油醚-乙醇-三乙胺-乙酸乙酯v/v 6 ∶2 ∶1 ∶1.5体系和石油醚-乙醇-三乙胺-乙酸乙酯v/v 4 ∶2 ∶1 ∶2体系梯度洗脱，按洗脱剂前沿1~3cm/min高度的上升速度开始干柱逆流柱层析直至洗脱剂前沿跑过硅胶H最上端、原拌样中样品在硅胶H柱上分出数条色带。③样品处理。取下色谱柱并底端连接打气筒小心把硅胶吹出到干净托盘中，把与薄层层析中GNA对应的谱带均匀分成3~5段，且每段取样TLC(展开剂石油醚-乙醇-三乙胺-乙酸乙酯v/v 1.2 ∶0.6 ∶0.2 ∶0.1)法检测其中GNA的纯度。分别合并以上含GNA纯品、较纯品的硅胶H，95%乙醇洗脱各段硅胶中的GNA至完全，洗脱液合并浓缩、称重后HPLC法检测纯度93%, ESI-MSm/z 631[M+H+]。
1.2.3 GA和GNA酸酰胺新实体的制备[9-10]1) N-(3-氯-4-氟苯基)藤黄酰胺的合成。25mL圆底烧瓶中依次取0.6mL 5.0mmol/L的GA二氯甲烷溶液(含3.0μmol GA)、0.72mL 5.0mmol/L的DIC二氯甲烷溶液(含3.6μmol DIC) 和0.6mL 1.0mmol/L的DMAP二氯甲烷溶液(含0.6μmol DMAP) 室温搅拌15min后，加入0.66mL 5.0mmol/L 3-氯-4-氟苯胺二氯甲烷溶液(含3.3μmol 3-氯-4-氟苯胺)。室温继续搅拌10h，至TLC(展开剂石油醚-乙醇-三乙胺v/v 4.5 ∶1 ∶1)检测反应液中GA斑点消失。加水淬灭反应后分出有机层，依次水洗(3mL)、1%盐酸(2mL)、水洗(3mL)后分出有机相无水硫酸镁干燥。滤除干燥剂滤液减压浓缩后，粗产物经干法上样、石油醚-乙醇-三乙胺-乙酸乙酯v/v 8 ∶1.2 ∶1 ∶1作洗脱剂的硅胶H干柱层析即得N-(3-氯-4-氟苯基)藤黄酰胺样品。ESI MS m/z 756[M+]; 1H NMR(CDCl3，400MHz)δ: 12.70(s, 1H, 6-OH), 8.01(s, 1H, NH), 7.56(d, J=7.1Hz, 1H, 10-H), 7.30~7.46(m, 3H, Ph-H), 6.77~6.83 (m, 1H, 27-H), 6.62(d, J=12Hz, 1H, 4-H), 5.01~5.08(m, 1H, 37-H), 3.46~3.51(m, 1H, 11-H), 3.27~3.36(m, 1H, 31a-H), 3.16~3.24(m, 1H, 31b-H), 2.93 (d, J=32Hz, 2H, 26-H), 2.66~2.75(m, 1H, 32-H), 2.54(d, J=9.4Hz, 1H, 22-H), 2.28~2.35 (dd, J=13.4, 4.7Hz, 1H, 21a-H), 1.98~2.07(m, 2H, 36-H), 1.31~1.81(m, 28H)。见图 1。
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图 1 N-芳基/烷基藤黄酰胺制备反应式 |
2) N-(2-N’, N’-二甲氨基)乙基藤黄酰胺的合成。25mL圆底烧瓶中依次取0.6mL 5.0mmol/L的GA二氯甲烷溶液(含3.0μmol GNA)、0.72mL 5.0mmol/L的DIC二氯甲烷溶液(含3.6μmol GNA) 和0.6mL 1.0mmol/L的DMAP二氯甲烷溶液(含0.6μmol DMAP) 室温搅拌15min后，加入0.50mL 10.0mmol/L(5.0μmol)N’, N’-二甲基乙二胺(DMEA)的二氯甲烷溶液。室温继续搅拌8h，至TLC(展开剂石油醚-乙酸乙酯v/v 4 ∶1)检测反应液中GA斑点消失。加水淬灭反应后分出有机层，水洗(2.5mL×2)后分出有机相无水硫酸镁干燥。滤除干燥剂滤液减压浓缩后，粗产物经干法上样、依次石油醚-乙酸乙酯v/v 10 ∶1和6 ∶1作洗脱剂的硅胶H干柱层析即得N-[2-(N’, N’-二甲氨基)乙基]藤黄酰胺样品ESI MS m/z698 (M+); 1H NMR(CDCl3，400MHz) δ: 12.70(s, 1H, 6-OH), 8.01(s, 1H, NH), 7.56(d, J=7.1Hz, 1H, 10-H), 6.77~6.83(m, 1H, 27-H), 6.62(d, J=12 Hz, 1H, 4-H), 5.01~5.08(m, 1H, 37-H), 3.46~3.51(m, 1H, 11-H), 3.27~3.36(m, 1H, 31a-H), 3.16~3.24(m, 1H, 31b-H), 2.93(d, J=32Hz, 2H, 26-H), 2.66~2.75(m, 1H, 32-H), 2.54(d, J=9.4Hz, 1H, 22-H), 2.28~2.35(dd, J=13.4, 4.7Hz, 1H, 21a-H), 1.98~2.07(m, 2H, 36-H), 2.40(dd, 2H, CH2), 2.26(dd, 2H, CH2), 2.20~2.23(s, 6H, 2CH3), 1.31~1.81(m, 28H)。见图 1。
3) N-(3-氯-4-氟苯基)新藤黄酰胺的合成。25mL圆底烧瓶中依次取0.6mL 5.0mmol/L的GNA二氯甲烷溶液(含3.0μmol GNA)、0.66mL 5.0mmol/L的DIC二氯甲烷溶液(含3.3μmol DIC)和0.6mL 1.0mmol/L的DMAP二氯甲烷溶液(含0.6μmol DMAP) 室温搅拌15min后，加入0.72mL 5.0mmol/L 3-氯-4-氟苯胺二氯甲烷溶液(含3.6μmol 3-氯-4-氟苯胺)。室温继续搅拌11h至TLC(展开剂石油醚-乙醇-三乙胺-乙酸乙酯v/v 4 ∶1)检测反应液中GNA斑点消失。加水淬灭反应后分出有机层，依次水洗(3mL)、1% 盐酸(2mL)、水洗(3mL)后分出有机相无水硫酸镁干燥。滤除干燥剂滤液减压浓缩后粗产物经干法上样、依次石油醚-乙酸乙酯v/v 10 ∶1和6 ∶1作洗脱剂的硅胶H干柱层析，即得N-(3-氯-4-氟苯基)新藤黄酰胺样品。ESI MS m/z758 (M+); 1H NMR(CDCl3) δ: 12.71(s, 1H, 6-OH), 8.01(s, 1H, NH), 7.70~7.58(m, 3H, Ph-H), 7.53(d, J=7.1Hz, 1H, 10-H), 6.43~6.46(m, 1H, 27-H), 5.84(m, 1H), 5.20(t, 1H, J=7.1, 7.0Hz, 3-H), 5.02~5.08(m, 1H, 37-H), 3.49(dd, 1H, J=4.6, 6.7Hz, 11-H), 3.17~3.36(m, 5H), 2.88(dd, 1H, J=5.6, 15.7Hz), 2.48(d, J=9.1Hz, 1H), 2.30(dd, J=4.6, 13.4Hz, 1H), 1.97~2.15(m, 4H), 1.31~1.81(m, 26H)。见图 2。
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图 2 N-芳基新藤黄酰胺制备反应式 |
本文使用的硅胶H逆流干柱梯度层析技术分离层带窄而整齐、分离度大、可获得较高柱效，与传统湿法硅胶柱色谱相比有分离操作简便、耗时短、溶剂消耗量小、分离效率高等优点。柱层析前用硅胶GF254薄层层析法找出GNA斑点与其它斑点Rf差值较大、成点性好的展开剂，按极性增大顺序直接用作硅胶H柱逆流梯度层析中的洗脱剂。
2.2 藤黄粉提取溶剂的确定从藤黄中提取GA、GNA时用丙酮代替甲醇作提取溶剂，能降低操作时的毒性且以上2种有效成分在丙酮中稳定性更大。
2.3 藤黄粉和新藤黄酸酰胺的设计理念4-氟-3-氯苯胺和2-(N’, N’-二乙氨基)乙胺，分别是第二代、不可逆的EGFR酪氨酸激酶抑制剂达克替尼、可口服的多靶点酪氨酸激酶抑制剂苏尼替尼中的结构片段。GA、GNA结构中引入4-氟-3-氯苯胺和结构相似的2-(N’, N’-二甲氨基)乙胺，可能降低毒性并提高抗肿瘤活性，且引入2-(N’, N’-二乙氨基)乙胺片段还可能改善它们的水溶性，均可改善其成药性。
2.4 藤黄酰胺类制备中缩合试剂的选择酰胺类的药物合成方法按上述操作N, N’-二环己基碳二亚胺(DCC)与1-羟基苯并三唑(HOBt)联合催化GA、GNA与脂肪胺的酰胺化，但与芳胺酰胺化时只得到中间产物活性酯。后改用DIC与DMAP按本文操作联合催化酰胺化，才成功得到N-芳基取代的藤黄酰胺和新藤黄酰胺。
以上GA、藤黄酰胺制备均以mmol/L浓度、μmol/L级的量进行。如其它条件不变而使用高浓度的相应试剂进行上述操作，反应速度则会增大。
利益冲突：所有作者均申明不存在利益冲突。
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