海洋微生物作为生物活性代谢物最丰富的来源之一，是先导化合物的重要源泉[1-3]。海洋真菌产生的次级代谢产物分子质量相对较小，但活性优良，多数化合物具有抗肿瘤、抗病毒、抗AD、免疫抑制和酶抑制等作用[4-6]。微生物变异是生物进化的基础推动力[7]，然而在人工培养的单一稳定环境下，微生物大部分基因簇通常处于沉默状态[8]，很多基因未能完全表达，而自然选育耗时长，工作量大且效率低。人工诱变育种可采用加入诱变剂、紫外照射、微波等加速微生物突变，从而在相对较短的时间内获得有实用价值的突变体，改善菌株特性[9-11]。本研究基于前期从牡蛎中分离得到的真菌Alternaria alternata，通过化学、物理以及复合诱导调控等方法，以期激活真菌的沉默基因簇，充分发掘微生物次级代谢的潜力，为获得大量新型结构活性天然产物提供信息支持。
1 材料和试剂 1.1 主要试剂和仪器葡萄糖、麦芽糖、乙酸乙酯(国药集团化学试剂有限公司)；UN1Q-10柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒(上海生工公司)；琼脂粉(青岛海博生物公司)；乙酰胆碱酯酶(苍蝇头部)、碘代硫代乙酰胆碱、DTNB、胰蛋白胨、DPPH、磷酸二氢钠、硫酸二乙酯(DES)、抗坏血酸等购自上海源叶生物科技有限公司。
恒温振荡培养箱(天津市莱玻特瑞公司)；恒温恒湿培养箱(上海精宏公司)；电泳仪(北京六一公司)；离心机(赛默飞公司)；超净工作台(苏州安泰公司)；立式蒸汽灭菌器(上海博讯公司)；EYELA旋转蒸发仪(上海爱朗公司)；高效液相色谱仪(岛津公司)；PCR扩增仪(美国伯乐公司)；全功能酶标仪(美国伯腾公司)。
1.2 方法 1.2.1 菌种来源本实验室前期从日照海域野生牡蛎中分离得到的真菌，经菌种鉴定为链格孢菌Alternaria alternata，命名为YS-4。金黄色葡萄球菌(S.aureus)和大肠杆菌(E.coli)-80℃保存于药学实验中心。
1.2.2 菌株诱变1) DES诱变。适量YS-4菌体接种至PDB培养基中，恒温振荡培养箱中培养3~7d，得到菌悬液。取适量菌悬液至5mL离心管中，充分研磨，测定其吸光度，用PDB培养基稀释，进行菌液浓度的预筛选。取700μL菌悬液置1.5mL离心管中，分别加入0、1、2、4、6、8、10μL DES，DMSO补至1000μL，混匀，放置4℃，按表 1进行诱变剂浓度的预筛选，12h和24h后分别于取菌悬液涂布、培养，连续观察15d，及时分离出新的菌株[12]。
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表 1 化学诱变剂(DES)浓度 |
2) 紫外诱变。菌悬液制备过程同1)，取菌悬液置PDA培养基，涂布，28℃培养箱培养24h，取出用20W紫外灯照射，照射距离20cm，照射时间分别为0、3、5、10、15、20、40、60、120、180、360s，密封放置在恒温培养箱中培养，连续观察15d，及时分离出新的菌株[13]。
3) 微波诱变。菌悬液制备过程同1)，取1mL菌悬液加入1.5mL EP管中，将EP管放置在冷却后烧杯中，用微波分别处理0、10、20、30、40、50、60s，密封、4℃冷藏12h涂布培养，连续观察15d，及时分离出新的菌株[14-15]。
4) 复合诱变。0.4% DES处理24h后，取200μL菌悬液置PDA培养基涂布培养12h，紫外照射60s，重新放至恒温培养箱中培养，连续观察15d，及时分离出新的菌株。
1.2.3 稳定性考察挑取诱变菌株的菌丝(母代)适量，在新PDA培养基上划线，培养箱中培养7~15d，同种方法连续10代接种培养，观察突变株的生长形态，以确定突变菌株的遗传稳定性。
1.2.4 菌种鉴定将诱变菌株接种至PDB培养基上，摇床中培养3~7d，吸取菌体至1.5mL EP管中，离心，弃上清，将菌体于冰浴中充分研磨，根据UNIQ-10柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取DNA，基于18S基因序列将提取得到的DNA，采用真菌通用引物ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')和ITS5 (5'-GGAAGTAAAAGTC GTAACAAGG-3')进行PCR扩增，PCR反应体系(1μL上、下游引物+10μL Mix+3μL DNA+6μL dd H2O)，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳纯化回收后，送至苏州金唯智公司测序。基因序列经Genbank数据库Blast对比，采用MEGA7.0软件的邻接法构建系统发育树[16]。
1.2.5 诱变菌株代谢产物的提取挑取适量诱变菌株的菌丝转移至500mL PDB培养基中，培养10~15d。将发酵液经离心、萃取得乙酸乙酯层，浓缩得粗浸膏，备用。
1.2.6 色谱条件采用Wondasil C18 Superb(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，以水(A)-甲醇(B)为流动相进行梯度洗脱(0~40min，5%B~100%B；40~50min，100%B；50~60min，100%B~5%B)，流速为0.8mL/min，检测波长为254nm，柱温35℃，进样量为10μL。
1.2.7 生物活性测定1) ACh E抑制活性测定。参照表 2，配制总体积为700μL的反应体系，37℃水浴260s，取200μL转移至96孔板中，平行3个复孔。412nm处测定其OD值，按公式计算其抑制率，盐酸多奈哌齐(Donepezil)为阳性对照。抑制率%=[(AⅡ-AⅠ)-(AⅣ-AⅢ)]/(AⅡ-AⅠ)×100%。
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表 2 Ellman法各组加样量(μL) |
2) 体外抗氧化活性测定。参照表 3加样反应，517nm处测定其OD值，按下列公式计算其清除率，VC为阳性对照。清除率(%)=[A阴性-(A样品-A本底)]/A阴性。
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表 3 DPPH法各组加样量(μL) |
3) 抗菌活性测定。将100μL指示菌的菌悬液均匀涂布在LB培养基上，培养12~16h，将培养皿分为四区并放置滤纸片，每个区域分别加入诱变菌株浸膏溶液和YS-4菌株的浸膏溶液(10mg/mL)，DMSO为阴性对照，利福平和氯霉素为阳性对照，恒温培养箱中倒置培养，分别在12、24、36、48、72h测量其抑菌圈大小。
1.2.8 数据的处理与分析采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析；采用MAGE 7.0中邻接法构建系统发育树。
2 结果 2.1 YS-4真菌及其突变菌株形态图野生菌株YS-4经过DES、紫外、微波以及复合诱变等方法分离得到48种菌株，经过稳定性考察后得到6种具有稳定遗传特性的突变菌株，其形态图见图 1。
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图 1 YS-4及其诱变菌株的形态图 |
基于18S基因序列，采用邻接法构建系统发育树，见图 2。野生菌株经诱变得到稳定遗传的菌株分别为聚多曲霉(Aspergillus sydowii)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、皮落青霉(Penicillium crustosum)、指状拟青霉(paecilomyces dactylethromorphus)、糙刺篮状菌(Talaromyces sp)和青霉菌(Penicillium sp)。
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图 2 诱变菌株系统发育树 |
与野生菌株YS-4粗提物的HPLC图谱相比，在波长254nm下，突变菌株YB-1和YB-17不同保留时间出现明显新峰，说明其突变菌株出现了新的次级代谢产物。见图 3。
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图 3 诱变菌株代谢产物的HPLC分析 |
采用Ellman法研究菌株代谢产物对ACh E的抑制活性。样品终浓度为200μg/μL时，野生真菌YS-4的粗提物对ACh E活性抑制率为45.22%，而突变菌株YB-1、YB-17和YB-23对ACh E抑制活性增强，其抑制率分别为55.86%、60.31%和49.67%，Donepezil为阳性对照，抑制率为75.50%(50μg/μL)。见图 4。
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图 4 YS-4及诱变菌株代谢产物对AChE活性抑制作用 |
采用DPPH自由基清除法研究菌株代谢产物的体外抗氧化活性。与YS-4相比(清除率为15.62%)，浓度为100μg/μL时，突变菌株YB-1、YB-17、YB-25对DPPH自由基的清除能力均有明显提高，清除率分别为41.72%、36.85%和23.59%。见图 5。
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图 5 YS-4及诱变菌株的代谢产物对DPPH自由基清除作用 |
与YS-4相比(抑菌圈直径为12mm)，YB-17、YB-23和YB-24对金黄色葡萄球菌的抑制作用增强，其粗提物(10mg/mL)抑菌圈直径分别为20、16和19mm，所有菌株对大肠杆菌E.coli无抑制作用。见表 4。
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表 4 不同真菌对受试菌种的抑菌圈直径(mm，x±s, n=3) |
通过对野生牡蛎内生真菌YS-4诱变育种，得到6株具有稳定遗传特性的突变菌株，分别为聚多曲霉(Aspergillus sydowii)，烟曲霉(Aspergillus fumigatus)，皮落青霉(Penicillium crustosum)，指状拟青霉(Paecilomyces dactylethromorphus)，糙刺篮状菌(Talaromyces sp)和青霉菌(Penicillium sp)。HPLC图谱分析可知，突变菌株YB-1和YB-17的代谢产物更为丰富；生物活性结果表明，突变菌株YB-1、YB-17和YB-23对AchE具有良好的抑制作用，抑制率分别为55.86%、60.31%和49.67%；YB-1、YB-17和YB-25对DPPH自由基的清除能力较强，清除率分别达41.72%、36.85%和23.59%；YB-17、YB-23和YB-24对金黄色葡萄球菌具有一定的抑制作用。本研究通过诱变方法激活牡蛎内生真菌的沉默基因簇，得到次级代谢产物具有良好生物活性的目标菌株，为进一步活性化合物的分离奠定基础。
利益冲突：所有作者均申明不存在利益冲突。
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