缺血性卒中发病率高于出血性卒中，占脑卒中总数的60%~70%。已成为老年人致残致死的最主要原因，给社会和家庭带来沉重经济和精神负担。对女性来讲，绝经前卒中发病率显著低于同年龄段男性，但绝经后则显著高于同年龄段男性，且预后更差[1]，说明雌激素对脑卒中具有保护作用[2]。Gibson等[3]证实雌激素能够减少脑卒中梗死容积。大样本临床研究显示，雌激素可减轻脑卒中发病率和死亡率，但同时也可以增加乳腺癌和子宫内膜癌等风险[4]。而植物雌激素对乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌等多种肿瘤细胞的增殖均有抑制作用[5]。葛根素是从野葛的根部分离出的一种异黄酮类化合物，属于植物性雌激素，具有和雌激素相似的作用，其对不同类型的神经性疾病具有一定保护作用，并且能增强去势大鼠的学习和记忆认知功能，减少海马CA1区神经元的凋亡[6]。
葛根素对去势脑缺血大鼠有何影响未见报道，本课题组拟利用去势脑缺血大鼠模型，观察葛根素对其学习记忆功能的影响并进一步探讨其机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验仪器低速自动平衡离心机(北京医用离心机厂，LDZ5-2)；组织匀浆机(IKA，KB5/10)；722型紫外分光光度计(上海精密科学仪器有限公司，707040913)；跳台仪(中国医学科学院药研所)；Multiskan FC型酶标仪(赛默飞世尔上海仪器有限公司，357-906301)；电热恒温培养箱(上海龙跃仪器设备有限公司，LI-9082)。
1.1.2 试剂葛根素注射液(山东方明药业集团股份有限公司，H20033292)；TTC染色液(美国索来宝公司，T8170)；丙二醛(MDA)测试盒(南京建成生物工程研究所，A003-1-2)；超氧化物歧化酶(SOD)测试盒(南京建成生物工程研究所，A001-3-2)；总蛋白定量测试盒(BCA法)(南京建成生物工程研究所，A045-4-2)；乙酰胆碱(Ach)测试盒(南京建成生物工程研究所)；乙酰胆碱酯酶(AchE)测试盒(南京建成生物工程研究所，A024)。
1.1.3 实验动物及分组清洁级健康SD雌性大鼠，15月龄，体重约220g，山东鲁抗医药股份有限公司提供(许可证号：SCXK(鲁)20130001)。实验前在恒温、恒湿实验室饲养1周，自由进食进水。将大鼠随机分为6组，正常对照组、OVX+2VO组、Sham-OVX+2VO组、葛根素低剂量组(25mg·kg-1)、中剂量组(50mg·kg-1)、高剂量组(100mg·kg-1)，每组8只。葛根素低剂量组(25mg·kg-1)、中剂量组(50mg·kg-1)、高剂量组(100mg·kg-1)在OVX和单侧颈总动脉结扎后，分别给予葛根素注射液0.2ml·100g-1腹腔注射，每天1次。其它组给予等体积蒸馏水，方法同上。所有动物实验符合动物伦理学要求。
1.2 方法 1.2.1 OVX+2VO大鼠模型制备10%水合氯醛(0.35ml/100g)腹腔注射将大鼠麻醉后，俯卧位固定，备皮并消毒，于雌性大鼠背外侧髋关节部位纵行剪开皮肤约1.5cm，钝性分离皮下组织和肌层，于腹腔内找到“菜花样”卵巢组织，结扎输卵管，切除双侧卵巢后闭合伤口。接着行颈部手术，暴露一侧颈总动脉，小心将血管和神经分离，结扎血管远心端和近心端，从中间将血管剪断，缝合伤口。1周后相同方法结扎另一侧颈总动脉，OVX+2VO模型制备成功。Sham-OVX+2VO大鼠只结扎双侧颈总动脉不切除卵巢。
1.2.2 TTC染色将大鼠麻醉(方法同上)后断头取脑，在-18℃冰箱中冷冻约20min，将鼠脑置入专用脑槽，连续切成6片，厚度2mm，依次放入十二孔板中，注入2% TTC染色液，避光，放入37℃恒温培养箱25min后，用无菌注射器将染色液抽出后，用4%多聚甲醛固定24h，正常大脑组织染成鲜红色，缺血组织呈苍白色，将染色完成的大脑组织按切片顺序排列，用数码相机拍照[7]。
1.2.3 WST-1法测定SOD活力将大鼠麻醉后断头取脑，立即放入装有冷生理盐水培养皿中，取出海马，称重后加9倍体积的生理盐水，剪碎组织，冰水浴制备匀浆，3000rpm，离心10min，取上清即10%组织原浆备用。严格按照试剂盒说明书提供步骤进行操作，各孔混匀后，37℃孵育20min，450nm处酶标仪读数，得到各孔OD值，将数据代入公式进行计算：SOD活力(U/mgprot)=SOD抑制率÷50%×反应体系稀释倍数(0.24ml/0.02ml)÷待测样本蛋白浓度(mgprot/ml)。
1.2.4 TBA法测定MDA含量按以上方法制备海马组织匀浆，严格按照试剂盒说明书提供步骤进行操作，离心管混匀后，95℃水浴40min，取出后流水冷却，然后4000rpm离心10min。取上清，532nm处，1cm光径，蒸馏水调零，测各管OD值。利用公式计算MDA含量：MDA含量(nmol/mgprot)=(测定OD值-对照OD值)/(标准OD值-空白OD值)×标准品浓度(10nmol/ml)÷待测样本蛋白浓度(mgprot/ml)。
1.2.5 AchE测定按以上方法制备海马组织匀浆，严格按照试剂盒说明书步骤操作。各管混匀后静置15min，波长412nm，0.5cm光径，双蒸水调零，测定各管OD值，利用公式计算组织中的AchE活力：AchE活力(U/mgprot)=(测定OD值-对照OD值)/(标准OD值-空白OD值)×标准品浓度(1μmol/ml)÷待测样本蛋白浓度(mgprot/ml)。
1.2.6 Ach测定按以上方法制备海马组织匀浆，严格按照试剂盒说明书步骤操作。各孔混匀后，静置10min，550nm处，取200ul于96孔板在550nm处酶标仪测定各孔OD值，利用公式计算Ach含量：Ach含量(ug/mgprot)=(测定OD值-测定空白OD值)/(标准OD值-空白OD值)×标准品浓度(400μg/ml)×样本测试前稀释倍数÷蛋白浓度(mgprot/ml)。
1.2.7 跳台实验实验分为训练期和实验期。训练期，将大鼠放到跳台箱内熟悉3min，然后通36V交流电5min，大鼠受到电击后，正常反应是跳上平台逃脱电击。如果大鼠始终没有跳上平台则弃去不用。训练结束24h后，再次将大鼠放入跳台内适应3min，通电5min，记录大鼠第一次跳上平台的时间(即跳台潜伏期)，观察大鼠在5min内跳下平台的次数(即错误次数)，若5min内大鼠未跳下平台，错误次数为0，跳台潜伏期为5min[8]。
1.3 统计学方法应用SPSS 19.0软件进行统计学分析。定量数据以x±s表示，多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用Dunnett-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组大鼠脑缺血情况正常对照组大鼠脑组织染成鲜红色，Sham-OVX+2VO组和OVX+2VO组脑缺血组织呈苍白色，给予葛根素治疗后，葛根素干预组脑缺血情况得到明显改善，随剂量增加，缺血面积逐渐减少。见图 1。
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图 1 TTC染色后各组大鼠脑切片缺血区比较 注：1-正常对照组；2-Sham-OVX+2VO组；3-OVX+2VO组；4-葛根素低剂量组；5-葛根素中剂量组；6-葛根素高剂量组。 |
与正常对照组比，Sham-OVX+2VO组和OVX+2VO组SOD活力均降低、AchE活性升高、Ach含量减少(P＜0.05)，OVX+2VO组MDA含量明显升高(P＜0.05)。与OVX+2VO组比，葛根素使SOD活力升高，且随剂量增加，作用明显增强(P＜0.05)；葛根素100mg·kg-1组能减低MDA含量(P＜0.05)，降低AchE活性(P＜0.05)升高Ach含量(P＜0.05)。见表 1。
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表 1 各组SOD活力、MDA含量、AchE活性及Ach含量比较(x±s) |
与正常对照组相比，Sham-OVX+2VO组和OVX+2VO组的潜伏期明显缩短(P＜0.05)，错误次数增多(P＜0.05)；与OVX+2VO组相比，葛根素50mg/kg组、葛根素100mg/kg组潜伏期明显延长(P＜0.05)，错误次数减少(P＜0.05)。见表 2。
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表 2 各组大鼠跳台实验潜伏期和错误次数比较(x±s) |
绝经后女性缺血性脑卒中发病率逐年上升，其所致患者死亡数约占女性死亡人数的1/6[9]。缺血后的后遗症多见，除引起运动和感觉异常外，还伴有认知功能障碍，严重影响患者的生活质量[10]。如何防治绝经后女性脑卒中已成为亟待解决的社会和医学难题。
本课题组采用OVX合并2VO制备去势脑缺血实验模型，能够较好地模拟绝经后女性伴发脑缺血的状态。TTC染色后，Sham-OVX+2VO组和OVX+2VO组脑缺血组织呈苍白色，且OVX+2VO组脑缺血更明显，说明OVX合并2VO加重脑缺血，可以解释为何绝经后女性缺血性脑卒中的发病率高于男性，且更严重。葛根素随剂量增加，大鼠脑缺血情况逐渐减轻，提示其对OVX合并2VO大鼠的缺血性损伤有保护作用。
脑组织发生缺血缺氧后，通过酶系或非酶系统产生氧自由基，过量的自由基攻击细胞膜中的多不饱和脂肪酸，引起脂质的过氧化反应，并形成MDA、酮基、羟基等脂质过氧化物，以及新的氧自由基。可见测定MDA含量能够反映体内脂质过氧化程度，间接反映缺血对细胞造成的损伤[11]。SOD对机体氧自由基具有清除能力，以防止自由基对细胞造成的损伤[12]。葛根素能降低MDA含量并随剂量增加升高SOD活力升高，提示其对缺血性脑损伤具有保护作用。
Ach是第一个被发现的脑内神经递质，主要涉及记忆、学习、运动和觉醒的调节。胆碱能神经末梢以胆碱和乙酰辅酶A为原料，在胆碱乙酰化酶的作用下合成Ach，合成后储存在突触前膜的囊泡内。当神经冲动到达神经末梢时，突触前膜与囊泡膜融合发生破裂，以胞裂外排的方式释放Ach，释放出的Ach在AchE的作用下水解失活。脑内的AchE主要分布在大脑额叶、顶叶和海马，而海马与学习记忆的关系最为密切，若海马组织中AchE活性增强，可降低神经突触间隙Ach水平，影响神经突触传递，导致学习记忆和认知功能降低[13-14]。本实验中，OVX+2VO组大鼠海马组织中AChE活性升高，Ach含量降低。葛根素干预后海马组织中AchE活性降低，Ach含量提高。在跳台实验中，葛根素组大鼠跳台潜伏期明显延长，错误次数减少，说明葛根素可能通过增强AchE活性提高去卵巢合并慢性脑缺血大鼠的学习记忆功能。
综上所述, 葛根素对去势脑缺血大鼠的学习记忆功能有改善作用，其机制可能与其抗氧化自由基作用减轻脑缺血所致损伤，同时抑制AchE活力，促进Ach的突触传递功能有关。
利益冲突：所有作者均申明不存在利益冲突。
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