冠心病严重威胁人类健康, 心肌缺血-再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI)是冠心病治疗过程中面临的一大挑战, 而寻求抵抗MIRI的药物具有重要的临床应用价值。目前认为, MIRI的损伤机制与自由基损伤、钙超载和炎性损伤等有关^[1]。

我们的前期研究表明, 侧柏叶(Cacumen Biotae, CB)乙酸乙酯提取物具有抗氧化应激、抗炎^[2]等功效, 因此我们推测CB乙酸乙酯提取物对MIRI有治疗作用。本文以心率、收缩压、血清肌酸激酶(creatine kinase, CK)、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase, LDH)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-a)、白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、乙酰胆碱(acetyl choline, ACH)以及心肌组织总一氧化氮合成酶(nitric oxide synthetase, NOS)为检测指标, 探讨CB对家兔MIRI的保护效应及其相关机制。

健康成年家兔32只, 体重2~2.5kg, 雌雄不限, 由山东大学实验动物中心提供。

侧柏叶取自济宁医学院本草园, 去枝干, 留针尖叶。石油醚分析纯(批号: 20130419)购自烟台三和化学试剂有限公司; 乙酸乙酯(批号: 20151214)购自上海山蒲化工有限公司; LDH(批号: 20170516)试剂盒、CK(批号: 20170511)试剂盒、IL-6(批号: 20170518)试剂盒、TNF-α(批号: 20170518)试剂盒、ACH(批号: 20170517)试剂盒以及NOS(批号: 20170511)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

新鲜侧柏叶200g, 清洗阴干后, 用粉碎机磨成粗粉, 并以1∶10的比例连续3次加水煎煮, 每次1.5h, 合并煎液并用抽滤装置过滤, 并将滤液于60℃以下用旋转蒸发仪浓缩, 然后用分液漏斗按照1∶1的比例, 先用石油醚萃取分层后取水层, 再用同等比例的乙酸乙酯萃取, 最后用旋转蒸发仪浓缩为浸膏, 得侧柏叶乙酸乙酯萃取物, 并置于4℃冰箱备用, 用蒸馏水将侧柏叶乙酸乙酯萃取物稀释为1×10³g/L的混悬液灌胃。

家兔被麻醉、仰卧位固定、气管插管后, 沿胸骨正中线右侧旁开1~2cm处切开皮肤, 钝性分离皮下组织, 暴露并剪断3~5根肋骨, 暴露心脏, 剪开心包膜, 提起右心耳, 将连有缝合线的无创小圆弯针从右冠状沟下方穿过, 再用套有橡胶管的细铁钩勾住缝合线的两端, 并缓慢拉入橡胶管, 之后再将家兔的肌肉和皮缝合, 并将橡胶管暴露在外。轻拉缝合线, 收紧橡皮管, 用止血钳同时钳住缝合线和橡胶管30min, 以此造成冠状动脉的缺血, 松开止血钳使心脏再灌注30min, 以此制备家兔心肌缺血再灌注的模型。实验过程中, 心电图Ⅱ导联显示ST段显著抬高或压低说明心肌缺血成功, 放松缝合线后, 心电图Ⅱ导联显示ST段或T波较前有回落, 说明再灌注成功。

健康成年家兔32只随机被分为假手术组、模型对照组、侧柏叶乙酸乙酯提取物组以及侧柏叶迷走神经切断组, 每组各8只。各组动物均按照图 1所示的实验流程进行操作, 心肌缺血30min再灌注30min后, 颈总动脉取血、取心脏后, 分别进行心肌切片TTC染色, 再次确认造模是否成功; 心肌总NOS含量测定(比色法)、血清CK、LDH含量测定(比色法)、血清TNF-α、IL-6含量测定(ELISA法)以及血清ACH含量测定(微板法), 以观察侧柏叶对家兔MIRI的保护效应及胆碱能抗炎通路在此过程中的作用。

图 1

图 1 实验操作流程 注: TTC.氯化三苯基四氮唑

采用SPSS17.0分析软件进行统计分析, 所有数据用表示, 组间比较采用单因素方差分析, 两两比较采用Bonferroni检验, 以P < 0.05为差异有统计学意义。

假手术组家兔手术前后收缩压和心率无明显变化(P > 0.05), 除乙酸乙酯提取物组心肌缺血后收缩压下降无统计学意义外, 其余各组家兔心肌缺血后收缩压均明显下降, 心率减慢(P < 0.05), 心肌缺血-再灌注后心率、收缩压进一步下降(P < 0.05)。与模型对照组相比, 侧柏叶乙酸乙酯提取物组心肌缺血-再灌注后心率和收缩压的下降率(缺血前-再灌注后30min/缺血前)明显降低(P < 0.01), 但与侧柏叶乙酸乙酯提取物组相比, 侧柏叶迷走神经切断组收缩压和心率的下降率明显升高(P < 0.01), 如表 1所示。

表 1

表 1 4组家兔心肌缺血-再灌注前后心率及收缩压的变化(n=8, x±s) 实验分组 心率/次·min-1 收缩压/mmHg 缺血前 缺血后30min t P 再灌注30min t P 缺血前 缺血后30min t P 再灌注30min t P 假手术组 300±13 293±14 1.04 0.32 302±16 0.27 0.79 109±10 114±12 0.91 0.38 106±9 0.63 0.54 模型对照组 299±15 202±13** 13.82 < 0.001 142±16** 19.99 < 0.001 113±11 90±12** 4.00 < 0.001 77±8** 7.49 < 0.001 乙酸乙酯提取物组 313±16 262±14** 6.79 < 0.001 220±17** 11.27 < 0.001 112±12 102±13 1.60 0.13 95±10* 3.08 0.01 侧柏叶迷走神经切断组 297±14 214±17** 10.66 < 0.001 161±15** 18.75 < 0.001 119±14 101±9* 3.06 0.01 83±7** 6.51 < 0.001 注：与缺血前相比，* P < 0.05，** P < 0.01

表 1 4组家兔心肌缺血-再灌注前后心率及收缩压的变化(n=8, x±s)

与假手术组相比, 模型对照组、侧柏叶乙酸乙酯提取物组以及侧柏叶迷走神经切断组血清CK、LDH含量明显升高(P < 0.01), 但与模型对照组相比, 侧柏叶乙酸乙酯提取物组和侧柏叶迷走神经切断组明显降低(P < 0.01), 而侧柏叶乙酸乙酯提取物组又明显低于侧柏叶迷走神经切断组(P < 0.01)。见表 2。

表 2

表 2 4组家兔心率和收缩压变化率以及血清LDH和CK含量比较(n=8, x±s) 心率变化率/% 收缩压变化率/% LDH/U·L-1 CK/U·L-1 假手术组 0.63±0.16 2.83±1.20 369.19±23.47 893.25±36.17 模型对照组 52.94±5.73** 40.49±4.82** 834.35±45.68** 1792.30±33.67** 乙酸乙酯提取物组 29.65±5.45**# 15.71±5.59**# 498.51±21.63**# 1265.91±78.50**# 侧柏叶迷走神经切断组 45.57±8.94***#△ 27.80±10.87**#△ 685.60±28.67**#△ 1659.24±69.07**#△ F值 120.74 47.96 341.65 395.47 P值 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 注：与假手术组相比，** P < 0.01；与模型对照组相比，# P < 0.01；与乙酸乙酯提取物组相比，△ P < 0.01

表 2 4组家兔心率和收缩压变化率以及血清LDH和CK含量比较(n=8, x±s)

与假手术组相比, 模型对照组、侧柏叶乙酸乙酯提取物组和侧柏叶迷走神经切断组血清Ach、TNF-α、IL-6含量明显升高(P < 0.01), 心肌组织总NOS含量明显降低(P < 0.01)。与模型对照组相比, 侧柏叶乙酸乙酯提取物组血清TNF-α、IL-6含量则明显降低(P < 0.01), 血清Ach和心肌组织总NOS含量明显升高(P < 0.01)。而侧柏叶乙酸乙酯提取物组血清TNF-α、IL-6含量明显低于侧柏叶迷走神经切断组(P < 0.01), 血清ACH以及心肌组织总NOS含量明显高于侧柏叶迷走神经切断组(P < 0.01)。见表 3。

表 3

表 3 4组家兔血清Ach、TNF-α、IL-6水平和心肌组织NOS含量比较(n=8, x ±s) 组别 ACH/pg·ml-1 TNF-α/ng·ml-1 IL-6/ng·ml-1 NOS/U·mg-1 假手术组 37.71±6.82 1.13±0.11 0.35±0.04 162.33±25.14 模型对照组 68.74±15.68** 1.79±0.29** 0.74±0.02** 108.99±17.61** 乙酸乙酯提取物组 99.17±15.32**# 1.35±0.12**# 0.43±0.04**# 145.42±21.33**# 侧柏叶迷走神经切断组 52.54±12.61**#△ 1.55±0.11**#△ 0.56±0.01**#△ 126.33±17.92**#△ F值 27.83 20.17 145.51 9.58 P < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 注：与假手术组相比，** P < 0.01；与模型对照组相比，# P < 0.01；与乙酸乙酯提取物组相比，△ P < 0.01

表 3 4组家兔血清Ach、TNF-α、IL-6水平和心肌组织NOS含量比较(n=8, x ±s)

目前, 冠心病发病率和死亡率逐年上升, 且发病年轻化趋势明显^[3-4]。冠状动脉再通是治疗冠心病的主要方法, 但冠状动脉再通后容易导致MIRI, 所以寻求能对抗MIRI的药物具有重要意义。我们的研究表明, 侧柏叶乙酸乙酯提取物能明显减小家兔MIRI心率和收缩压的降低率, 显著减弱血清心肌酶CK和LDH的升高, 提示侧柏叶对MIRI具有保护作用, 这将对冠心病的治疗提供重要的参考依据。

在人类及哺乳动物, 窦房结、右心房、右心室、房室结、左室后壁等均接受右冠状动脉的供血^[5], 因此右冠状动脉供血不足可导致心率减慢和收缩压降低。缺血-再灌注后可使心肌细胞水肿、胞膜和线粒体的损伤进一步加剧^[6]。这可能是导致心肌缺血-再灌注后心率与收缩压进一步降低的原因^[7]。心肌内存在大量的心肌酶, 在心肌细胞膜通透性增加或心肌缺血性坏死时, 大量的心肌酶释放入血, 引起血清中心肌酶升高, 而血清心肌酶的升高程度在某种程度上与心肌细胞的损伤成正相关^[8]。在本研究中, 侧柏叶能明显降低家兔MIRI后血清CK和LDH水平, 明显减小心率和收缩压的降低率, 提示侧柏叶对家兔心肌MIRI具有保护作用。

Bernik等^[9]研究发现, 刺激迷走神经能明显减轻大鼠心肌缺血-再灌注模型的炎症反应, 而切断迷走神经后这种保护效应消失。Li等^[10]研究也发现, 在大鼠心肌缺血-再灌注模型, 给予a7烟碱型乙酰胆碱受体激动剂后能明显减少缺血心肌的炎性细胞浸润, 降低心肌酶含量, 减轻心肌的超微结构损伤。以上结果提示, 在一定程度上, 迷走神经活性增强能明显减轻心肌MIRI。在本研究中, 侧柏叶能明显减小心肌缺血-再灌注后收缩压、心率的降低率, 但在迷走神经切断后, 侧柏叶的以上保护作用明显减弱, 提示迷走神经切断后侧柏叶对心肌MIRI的保护作用明显减小, 说明迷走神经在此过程中作用关键。已有研究证实, 迷走神经释放的乙酰胆碱通过结合免疫细胞表面的a7烟碱型乙酰胆碱受体阻断NF-κB通路, 抑制炎性因子及TNF-a和IL-6等细胞因子的表达。而大量释放的TNF-α和IL-6等却能激活NF-κB通路, 下调NOS的表达, 诱发细胞凋亡, 加重心肌损伤。在本研究中, 侧柏叶能明显降低心肌缺血-再灌注后血清TNF-α和IL-6水平, 增加血清Ach及心肌组织NOS含量, 提示侧柏叶对MIRI的保护作用与胆碱能抗炎通路有关。而迷走神经切断后, 侧柏叶的以上作用明显减弱, 进一步提示侧柏叶对MIRI的保护作用与胆碱能抗炎通路有关。