槐耳，中药全名为槐栓菌，学名Trametes robiniophila Murr，属于木耳科真菌，是一种生长在老龄中国槐树上的高等真菌子实体^[1]。槐耳是我国传统医学重要的药用真菌^[2]，具有“治风，破血，益力”功效^[3]，民间常用于治疗癌症和炎症^[4]。槐耳清膏(Huaier aqueousextract)是槐耳的提取产物，其最主要的活性成分为多糖蛋白^[5]。多项研究证实，槐耳清膏可明显增强机体细胞免疫应答，具有免疫调节、抗肿瘤及抗病毒等功能^[6]。目前，有关槐耳的研究主要集中于抗肿瘤及其免疫调节活性的研究^[7-9]，而对其抗炎活性研究较少。内毒素是革兰阴性菌细胞膜外膜的主要组成成分，其化学本质为脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS)。LPS可诱导机体产生炎症及炎症性细胞因子的释放，常用于制备脓毒症模型^[10]。本实验使用LPS构建小鼠脓毒症模型^[11]，探讨槐耳清膏对机体的抗炎活性及作用机制，为槐耳及其复方制剂槐杞黄的临床应用提供参考。

实验采用ICR健康小鼠，体质量243g，雌雄各半，由青岛市实验动物和动物实验中心提供，动物合格证号：SCXK(鲁)2003001001。

槐耳清膏(启东盖天力药业有限公司赠送)，LPS(索莱宝科技有限公司)，反转录试剂盒(Thermo Scientific Fermentas公司)，酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(武汉基因美生物科技公司)。荧光定量PCR仪(Bio-Rad公司)、酶标仪(Thermo Fisher Scientific公司)、DYY-7C电泳仪(北京六一公司)、凝胶成像分析仪(Bio-Rad公司)。

50只ICR小鼠饲养一周后，随机分为5组：正常对照组、LPS组、槐耳清膏低剂量组(4mg/kg)、中剂量组(6mg/kg)和高剂量组(8mg/kg)，每组10只。采用腹腔注射LPS制备小鼠致炎模型。采用灌胃给药，槐耳低、中、高组分别灌服不同浓度的槐耳清膏0.2ml/只/d，正常对照组和LPS组灌服给予等体积的生理盐水，共计7d。第7天灌胃后0.5h，每组腹腔注射等体积的LPS 0.2ml(10mg/kg)，正常对照组注射等体积的生理盐水。

注射LPS 6h后，称重后处死小鼠，分离脾脏，用滤纸拭去表面残留血液，立即称重。脾脏指数：脾脏指数=脾脏质量(mg)/体质量(g)^[12]。

取小鼠肺组织于4%的多聚甲醛中固定，常规HE染色，切片机连续切片，厚度4~6μm。镜下观察，全景扫描。

注射LPS 6h后，取小鼠外周血于室温静置10min，2500rpm离心20min，分离血清，参照ELISA试剂盒说明书进行操作，加入终止液后，使用多功能酶标仪，分别测量各个样本内IL-6、TNF-α表达水平。

取小鼠脾脏组织0.1g，Trizol法提取小鼠总RNA，反转录获得cDNA后行RT-qPCR检测IL-6、TNF-α mRNA表达水平。引物序列参照表 1。

表 1

表 1 引物序列 Gene Primer Gene sequence (5'to 3') GAPDH F ATTCAACGGCACAGTCAAGG R GCAGAAGGGGCCGGAGATGA TNF-α F ACCGTCAGCCGATTTGCTAT R CCGGACTCCG CAAAGTCTAA IL-6 F AGAGACTTCCATCCAGTTGCC R CCGGACTTGTGAAGATGGGAA

表 1 引物序列

实验数据以x±s表示，多组数据比较采用ANOVA分析，组间两两比较采用Bonferroni检验，所有分析采用SPSS 19.0统计软件，P < 0.05为差异有统计学意义。

LPS组脾脏指数较正常对照组均明显升高，说明LPS致炎症模型制备成功。槐耳中、高剂量组的脾脏指数较LPS组显著降低(P < 0.05)。见表 2。

表 2

表 2 5组小鼠脾脏指数比较(x±s, n=10)   分组 脾脏指数/mg·kg-1 正常对照组 3.70±0.48 LPS组 5.09±0.80* 槐耳低剂量组 5.01±1.03 槐耳中剂量组 4.11±0.76** 槐耳高剂量组 3.62±0.69**   F值 8.37   P < 0.05 注：与正常对照组比较，*P < 0.05；与LPS组比较，**P < 0.05。

表 2 5组小鼠脾脏指数比较(x±s, n=10)

LPS组小鼠肺泡内有炎症性细胞的大量浸润，肺泡壁增厚，肺泡上皮细胞增生明显(图 1A)。与LPS组相比，槐耳高剂量组肺组织内有少量的炎症性细胞浸润，肺泡组织及肺泡支气管均无明显变化(图 1B)。

图 1

图 1 LPS组(A)和槐耳高剂量组(B)小鼠肺组织HE染色(×100)

LPS组小鼠血清IL-6、TNF-α的表达与正常对照组相比显著上升，炎症性细胞因子的表达升高，说明LPS致炎小鼠造模成功。槐耳中、高剂量组IL-6、TNF-α表达较LPS组明显降低，而槐耳低剂量组无显著变化。见表 3。

表 3

表 3 5组小鼠IL-6、TNF-α比较(x±s, n=10) 分组 IL-6/pg·ml-1 TNF-α/pg·ml-1 正常对照组 24.86±4.63 35.30±4.35 LPS组 52.22±8.41* 56.40±5.97* 槐耳低剂量组 50.79±5.02 53.91±4.74** 槐耳中剂量组 40.70±5.01** 39.51±5.31** 槐耳高剂量组 37.65±6.35** 34.94±5.12** F值 33.73 40.91 P < 0.05 < 0.05 注：与正常对照组比较，*P < 0.05；与LPS组比较，**P < 0.05。

表 3 5组小鼠IL-6、TNF-α比较(x±s, n=10)

LPS组小鼠IL-6、TNF-α mRNA表达较正常对照组均显著上升，提示LPS致小鼠脾脏炎症。与LPS组相比，槐耳高剂量组IL-6、TNF-α mRNA表达均有所下降，而中、低剂量组无明显变化，(P < 0.05)。见表 4。

表 4

表 4 5组小鼠脾脏IL-6、TNF-α mRNA表达的比较(x±s, n=10) 组别 TNF-α IL-6 正常对照组 1.04±0.11 1.05±0.12 LPS组 3.02±0.84* 3.16±0.89* 槐耳低剂量组 2.29±0.88 2.64±0.22 槐耳中剂量组 1.44±0.25** 1.42±0.21** 槐耳高剂量组 1.29±0.19** 1.32±0.15** F值 21.24 46.87 P < 0.05 < 0.05 注：与正常对照组比较，*P < 0.05；与LPS组比较，**P < 0.05。

表 4 5组小鼠脾脏IL-6、TNF-α mRNA表达的比较(x±s, n=10)

炎症是机体对刺激的一种防御反应，但过度炎症反应与许多疾病密切相关，比如心血管系统疾病^[13]、癌症^[14]等，因此对炎症的监测和控制对多种疾病意义重大^[15]。其中，由细菌等生物病原体引起的炎症又称感染性炎症；LPS为是革兰氏阴性细菌细胞壁的一种成分，可以激活机体产生IL-6、TNF-α等大量炎性因子，从而导致机体出现发热、毛细血管通透性增加和中性粒细胞浸润等多种炎性反应。本实验采用腹腔注射LPS法制备小鼠炎症模型，结果显示LPS模型组小鼠出现了行动迟缓、精神不振等现象，同时检测发现血清及脾脏组织中炎症性细胞因子IL-6、TNF-α的表达显著增加，LPS模型组小鼠肺脏出现大量中性粒细胞浸润，炎症反应明显，这也与既往文献报道一致^[16-17]，说明LPS致脓毒症模型小鼠制备成功。

槐耳是我国古代医学重要的药用真菌，具有“治风，破血，益力”的功效^{[3, 18]}。现代医学观点，“治风，破血”即为消炎，“益力”可以理解为增强免疫力。槐耳是一味不可多得的抗炎中药，其抗炎活性和相关抗炎机制，值得深入研究。目前对槐耳及其复方制剂的研究主要集中于其抗肿瘤活性及调节免疫作用，而对其最传统的抗炎活性研究尚少。因此，本实验重点研究槐耳的抗炎活性。

TNF-α是一类由活化的巨噬细胞和NK细胞释放的促炎性细胞因子，参与局部炎症和内皮细胞的活化。急性炎症时，炎症局部产生的TNF-α可提高中性粒细胞的吞噬活性，促进白细胞分化^[19-21]。IL-6也是多效性的炎症性细胞因子，是形成炎性介质网络的关键成分，在炎症反应中起重要作用。IL-6不仅参与炎症反应，而且直接导致炎症的发生，同时也通过促进其他炎症因子的释放间接导致炎症，激活中性粒细胞，因此，IL-6既是炎症反应的重要介质，也是促进炎症的始动因素^[22]。本文结果显示，槐耳中、高剂量组小鼠外周血血清及脾脏组织中IL-6、TNF-α水平均显著降低，提示较高浓度的槐耳清膏可以下调体内TNF-α和IL-6的表达，其机制可能是槐耳清膏可以有效地减少由LPS所致炎症引发的TNF-α和IL-6的过度释放，清除体内的炎症介质，减少炎症的渗出，促进炎症吸收，抑制LPS所致炎症。

综上所述，槐耳清膏对LPS致小鼠炎症模型有很好的抗炎活性，可能通过抑制炎症性细胞因子的过度释放，减轻机体炎症性细胞浸润来降低机体炎症反应，为治疗与炎症密切相关的肿瘤、心血管疾病等提供了新的治疗思路。