溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一类病因不明的非特异性胃肠道慢性炎症性疾病，临床主要表现为腹痛、腹泻和黏液脓血便，病程迁延，反复发作，较难治愈，严重影响患者的生活质量[1]，该病在我国发病率呈升高趋势[2]。肠道感染和炎症破坏肠黏膜屏障功能，引起肠黏膜通透性发生改变，肠腔内各种抗原暴露于黏膜固有层免疫系统，引起促炎因子表达及释放增加，抗炎因子水平下降，使肠道炎症损伤进一步加重[3]。目前，UC的主要治疗药物为抗炎药、皮质类固醇以及免疫调节药物等，但长期使用可引起严重不良反应[4]。
大蒜素是一种天然含硫化合物，具有多种生物学功效，如抗菌、抗氧化应激、并具有调节免疫等作用[5-6]。大蒜素可减少小鼠炎症组织内IL-1β、TNF-α和NF-κB的表达，使SOD、GSH-Px活性减弱，从而发挥抗炎性痛作用[7]。本文将探讨大蒜素对葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎BALB/c小鼠的治疗作用及其可能机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 动物与分组健康SPF级BALB/c小鼠60只，雌雄各半，体重20~25g，随机分为3组，分别为正常组、DSS模型组、大蒜素组(2g·L-1)，每组20只。习服1周后，进行实验。将动物饲养在25℃~27℃室温中，12h光照、12h黑暗交替循环。所有实验动物均遵守国家实验动物饲养管理条例和使用指南。
1.1.2 药品与试剂大蒜素胶囊，购自江苏正大清江制药公司；葡聚糖硫酸钠(MW 36000-50000)购自大连美仑生物技术有限公司；小鼠肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA试剂盒购自上海通蔚生物科技有限公司(货号：TW78293-2)；髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)检测试剂盒购自上海研谨生物技术有限公司。
1.1.3 仪器Z306高速离心机购自德国HERMLE；CUT 4062手动旋转式病理切片机购自德国SLEE公司；MR-96A酶标仪购自深圳迈瑞生物医疗电子股份公司。
1.2 方法 1.2.1 模型的制备正常组小鼠自由饮用蒸馏水，其余各组自由饮用5% DSS溶液，连续7d，诱导UC模型。造模1d开始灌胃给药，大蒜素组于造模1d予大蒜素，剂量0.02ml/g体重，连续给药7d。
1.2.2 各小组小鼠疾病活动指数(disease activity index，DAI)评估[8]每日给药前，测量小鼠体重，观察小鼠的精神、活动状态以及大便情况。评估各组小鼠DAI。DAI=(体重下降分数+腹泻分数+便血分数)/3。
1.2.3 病理学检测末次给药后，小鼠禁食24h，1.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，眼眶取血，3000r·min-1，离心15min，取血清，-20℃冰箱保存。取血后，脱臼处死小鼠，采集小鼠直肠至盲肠末端结肠组织，测量长度，纵向剪开肠腔，预冷生理盐水清洗，中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，5μm厚，连续切片，HE染色。
1.2.4 小鼠血清中TNF-α水平测定取冷冻保存的小鼠血清，室温溶解，按照TNF-α ELISA检测试剂盒使用说明进行操作。
1.2.5 各组小鼠结肠组织中MPO活性检测取小鼠结肠组织50mg，加入PBS匀浆，10min；将组织匀浆液反复冻融(-80℃/37℃), 3次；4℃，3000r·min-1，离心20min，取上清液，严格按MPO测定试剂盒说明书进行操作，检测小鼠结肠组织MPO活性。
1.3 统计学方法本实验中采用SPSS22.0软件进行统计学分析，所用数据均以x±s表示，多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用Dunnet-t检验，P＜0.025被认为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 小鼠一般情况在给药期间，正常组小鼠精神状态良好，饮食、活动正常，皮毛有光泽，大便正常。模型组小鼠在给药第3天进食量减少，并出现体重减轻、皮毛枯燥、精神不振现象，第4天肛周出现大便粘附、血便，第5天和第6天各有1只小鼠死亡。模型组DAI评分明显高于正常组(P＜0.025)，大蒜素组小鼠一般情况优于模型组，个别小鼠出现腹泻、大便不成形，体重减轻，无小鼠死亡，DAI评分明显低于模型组(P＜0.025)。见图 1。
|
图 1 蒜素对UC BALB/c小鼠DAI的影响 |
模型组小鼠结肠长度[(4.54±0.49)cm]显著性低于正常组[(8.72±0.26)cm]和大蒜素组[(8.08±0.83)cm](P＜0.025), 大蒜素组小鼠结肠长度与正常组相比不存在显著性差异(P＞0.05)。见图 2。
|
图 2 大蒜素对UC BALB/c小鼠结肠长度的影响 注：模型组vs正常组，*P＜0.025；大蒜素组vs模型组，#P＜0.025 |
与正常小鼠结肠组织相比，模型组小鼠结肠组织粘膜层表面不规则，局部坏死、脱落，粘膜层缺损，腺体结构破坏，杯状细胞减少，粘膜固有层内可见肉芽组织和新生毛细血管形成，粘膜下层充血、水肿，大量中性粒细胞和淋巴细胞浸润。与模型组相比，大蒜素组小鼠结肠粘膜层和肌层炎症性病变较模型组明显减轻，肠壁结构较完整，隐窝可见，肌层较完整，未见新生组织，仍有部分炎性细胞浸润。见图 3。
|
图 3 大蒜素对UC BALB/c小鼠结肠损伤的影响(×100) 注：A.正常组；B.模型组; C.大蒜素组 |
模型组小鼠血清中TNF-α水平[(97.4±4.8)ng·ml-1]明显高于正常组[(38.28±1.9)ng·ml-1](P＜0.025)；大蒜素组小鼠血清中TNF-α水平[(42.8±3.2)ng·ml-1]明显低于模型组(P＜0.025)，与正常组相比无显著性差异。见图 4。
|
图 4 大蒜素对UC BALB/c小鼠血清TNF-α的影响 注：模型组vs正常组，*P＜0.025；模型组vs大蒜素组，#P＜0.025 |
模型组小鼠结肠组织MPO活性[(2.15±0.21)U·g-1]明显高于正常组[(0.13±0.05)U·g-1](P＜0.025)；大蒜素组小鼠结肠组织MPO的活性[(0.93±0.33)U·g-1]明显低于模型组(P＜0.025)。
|
图 5 大蒜素对UC BALB/c小鼠结肠组织MPO活性的影响 注：模型组vs正常组，*P＜0.025；大蒜素组vs模型组，#P＜0.025 |
近年来，UC已成为人类最常见的炎症性肠道疾病，其发病率在世界范围内呈现逐渐上升的趋势，但目前仍无根治方法。长期慢性肠道炎症可引起基因不稳定、细胞增殖并逃避凋亡，最终可能引起癌变[9]，因此，UC的预防和治疗日益引起人们的重视。UC的发病机制尚不明确，可能与机体出现异常免疫反应相关。肠道黏膜内促炎因子和抗炎因子之间平衡失调，使炎症反应进一步加强，从而引起肠道组织损伤[3]。目前常用的治疗药物可引起严重不良反应，限制了其使用。
UC患者肠道中MPO表达量增加，可作为肠上皮隐窝内和肠粘膜层内中性粒细胞聚集、浸润引起结肠上皮损伤的重要标志[10]。使用大蒜素治疗可降低小鼠体内MPO浓度，并使其活性降低[11]。本研究中，模型组小鼠结肠组织中MPO浓度明显高于正常组，说明使用DSS成功诱导小鼠溃疡性结肠炎模型。与模型组相比，大蒜素组MPO浓度明显降低，这与其DAI评估结果和结肠组织病理学观察结果一致。大蒜素处理组小鼠结肠组织中MPO活性明显降低，表明大蒜素可减轻中性粒细胞聚集，减轻结肠组织内炎症反应程度，从而减轻肠道炎症反应的发生和进一步进展。UC发生、发展过程中产生大量炎症细胞因子，其中，TNF-α是UC发生发展的关键物质之一，也是近年来该领域研究的热点[12]。目前认为，TNF-α主要通过自分泌和旁分泌途径发挥局部炎症细胞活化与趋化作用[13]。有研究发现，UC患者血清TNF-α浓度是健康体检者的380倍[14]，TNF-α可激活内皮细胞NF-κB信号通路，活化的NF-κB进入细胞核参与多种促炎因子的产生，增强其对单核细胞的趋化、粘附作用，进一步加重炎症反应，在促进炎症产生中起重要作用[15]。本研究中，DSS诱导的UC小鼠体内TNF-α明显增高，而经大蒜素灌胃后，可显著降低UC小鼠体内TNF-α浓度水平。表明大蒜素可减轻UC小鼠结肠的炎症反应，进而改善其病变程度。大蒜素来源广泛，成本低，毒副作用小，有望成为一种新型抗UC药物。
| [1] |
Marafini I, Sedda S, Dinallo V. Inflammatory cytokines:from discoveries to therapies in IBD[J]. Expert Opin Biol Ther, 2019, 19(11): 1207-1217. DOI:10.1080/14712598.2019.1652267 |
| [2] |
Yang H, Li Y, Wu W, et al. The incidence of inflammatory bowel disease in Northern China:a prospective population based study[J]. PLoS One, 2014, 9(7): e101296. DOI:10.1371/journal.pone.0101296 |
| [3] |
Salim SY, Soderholm JD. Importance of disrupted intestinal barrier in inflammatory bowel diseases[J]. Inflamm Bowel Dis, 2011, 17(1): 362-381. DOI:10.1002/ibd.21403 |
| [4] |
Gupta RA, Motiwala M N, Mahajan UN, et al. Protective effect of Sesbania grandiflora on acetic acid induced uleerabive colitis in mice by inhibition of TNF-α and IL 6[J]. J Ethnopharmacol, 2018, 219: 222-232. DOI:10.1016/j.jep.2018.02.043 |
| [5] |
王建平, 宋焱峰, 景玉宏, 等. 大蒜素对小鼠胃肠运动及血清中胃动素、生长激素释放肽的影响[J]. 中国药房, 2015, 26(7): 950-952. |
| [6] |
Chan JY, Tsu Hi, Chung IY, et al. , Allicin protects rat cardiomyoblasts (H9c2 cells) from hydrogen peroxide-induced oxidative injury through inhibiting the generation of intra cellular reactive oxygen species[J]. Int J Food Sci Nutr, 2014, 65(7): 868-873. DOI:10.3109/09637486.2014.925428 |
| [7] |
任亮, 任翔, 刘金宝, 等. 大蒜素对模型小鼠的抗炎性痛作用及机制研究[J]. 中国药房, 2018, 29(18): 2479-2483. |
| [8] |
Jeon Y D, Bang K S, Shin M K, et al. Regulatory effects of glycyrrhizae radix extract on DSS induced ulcerative colitis[J]. BMC Complement Altern Med, 2016, 16(1): 459. DOI:10.1002/ibd.21403 |
| [9] |
Kundu JK, Surh YJ. Inflammation:gearing the journey to cancer[J]. Mutat Res, 2008, 659(1-2): 15-30. DOI:10.1016/j.mrrev.2008.03.002 |
| [10] |
Li RY, Chen YY, Shi MJ, et al. Gegen Qinlian decoction alleviates experimental colitis via suppressing TLR4/NF-κB signaling and enhancing antioxidant effect[J]. Phytomedicine, 2016, 23(10): 1012-1020. DOI:10.1016/j.phymed.2016.06.010 |
| [11] |
Zhang L, Wang E, Chen F, et al. Potentialprotective effects of oral administration of allicin on acrylamide induced toxicity in male mice[J]. Food Funct, 2013, 4(8): 1229-36. DOI:10.1039/c3fo60057b |
| [12] |
Araki A, Nara H, Rahman M, et al. Role of interleukin21 isoform in dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis[J]. Cytokine, 2013, 62(2): 262-271. DOI:10.1016/j.cyto.2013.03.006 |
| [13] |
张欣, 李洺, 杨嫣华. 炎症性肠病患者血清TNF-α、IL-35水平变化及其临床意义[J]. 内科急危重杂志, 2017, 23(5): 400-402. |
| [14] |
Xiao B, Laroui H, Ayyadurai S, et al. Mannosylated bioreducible nanoparticle-mediated macrophagespecific TNF-α RNA interference for IBD therapy[J]. Biomaterials, 2013, 34(30): 7471-82. DOI:10.1016/j.biomaterials.2013.06.008 |
| [15] |
江颖娟, 蒋作锋, 吴小兰. 槲皮素对TNF-α诱导内皮细胞炎症因子表达的影响[J]. 新医学, 2017, 48(10): 697-700. |