细菌素是一类由细菌核糖体编码合成,对同种亲缘的微生物具有高效抑制的一类多肽或前体多肽[1],绿色环保、安全高效,被视为抗生素的理想替代品。乳酸链球菌素(Nisin)是唯一通过FDA/WHO双认证,商业化应用于食品领域的细菌素。Nisin在碱性条件下不稳定,以及仅能抑制革兰氏阳性菌,对革兰氏阴性菌和真菌等抑制作用效果较差[2]等因素,限制了其应用范围。芽孢杆菌可以代谢产生多种细菌素,与Nisin相比,大部分芽孢杆菌细菌素具有耐高温、耐酸碱、广谱抑菌的特性[3-4],具有较高的应用前景。
本文拟从高温酒曲中筛选产细菌素的芽孢杆菌,研究其生物学特性,拟开发一种在食品、医药领域具有应用价值的细菌素。
1 材料与方法 1.1 实验材料与仪器 1.1.1 样品来源高温酒曲,由山东梁山县儒匠酒曲有限公司提供。
1.1.2 菌株指示菌:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus CMCC 26112)。实验菌:大肠杆菌(Escherichia coli ATCC25922),铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa ATCC27853),白色念珠菌(Candida albicans ATCC14053),痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae CMCC 51252),黑曲霉ATCC16404。以上菌株均由济宁医学院生物科学实验中心提供。
1.1.3 主要仪器与试剂全温叠加式摇床(天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司);PCR仪(BIO-RAD公司);电泳仪(北京六一公司);全自动免染凝胶成像分析系统(BIO-RAD公司)。
LB培养基(上海生工生物工程有限公司);细菌基因组DNA抽提试剂盒(北京天根生化科技有限公司);TaqDNA聚合酶(北京宝日医生物技术有限公司);蛋白酶K(北京索莱宝科技有限公司);胰蛋白酶(北京索莱宝科技有限公司);PageRuler预染蛋白分子(上海赛默飞世尔科技有限公司);其它试剂均为日照国药分析纯试剂。
1.2 方法 1.2.1 产细菌素芽孢杆菌的筛选将10ml无菌水中加入1g高温酒曲,于70℃保温30min,取5ml悬浮液于LB培养基中,37℃、200rpm振荡培养24h。稀释适当倍数涂布于LB平板,于37℃培养24h。挑选单菌落菌株接种于LB培养基中,37℃、200rpm振荡培养24h。8×103rpm离心去菌体,发酵上清液中缓慢加入固体硫酸铵,至其终浓度为60%,并置于4℃冰箱中隔夜处理,再经1×104rpm离心10min,获得盐析沉淀,并将其溶于原体积1/50的0.02mol/L pH 7.0磷酸钠缓冲液中,制成细菌素溶液,进行抑菌活性测定。
1.2.2 产细菌素芽孢杆菌的种属鉴定参考文献方法[5-6],以细菌基因组DNA抽提试剂盒提取的菌株基因组DNA为模板,采用16S区通用引物27F/1492R,进行PCR扩增。PCR体系:菌基因组DNA提取物0.5μl,10×PCR缓冲液2.5μl,dNTP Mixture 2μl,引物27F/1492R对各1μl,TaqDNA聚合酶0.5μl,补无菌水至25μl。PCR反应条件:94℃预变性3min;94℃变性45s,53℃退火45s,72℃延伸90s,循环扩增34个循环;72℃延伸7min;PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳验证后,送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序,将测得的16S rDNA基因序列在NCBI网站上进行同源性比对,鉴定菌株种属。
1.2.3 细菌素的分离纯化将发酵液加热至100℃,保温5min,1×104rpm离心10min,留上清,调节pH为2.0使蛋白絮凝沉淀,1×104rpm离心10min。将获得的蛋白沉淀溶于原体积1/50的0.02mol/L pH 7.0磷酸钠盐缓冲液中,而后加入固体硫酸铵,至其终浓度为8%,4℃冰箱静置2h,1×104rpm离心10min,将获得的蛋白沉淀溶于等体积0.02mol/L pH 7.0磷酸钠缓冲液中。重复上述盐析步骤2次,将得到的细菌素溶液按1.3.2中Tricine-SDS-PAGE方法进行电泳。
1.2.4 细菌素对pH、温度、蛋白酶耐受性的测定将纯化的细菌素溶液pH分别调节为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0,然后置于37℃处理4h,再将pH调至7.0,按1.3.1方法测定抑菌活性。
将纯化的细菌素溶液,分别置于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃条件下处理30min,以及100℃、110℃、120℃分别处理10min、20min、30min,按1.3.1方法测定抑菌活性。
向0.2ml纯化的细菌素溶液中(预先调整至各个酶的最适合pH,胃蛋白酶样品pH 2.5),分别加入0.05ml浓度为5mg/ml的蛋白酶溶液(胃蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶),然后置于37℃处理6h,再将pH调至7.0,按1.3.1方法测定抑菌活性。以未加蛋白酶处理的样品为对照。
1.3 检测方法 1.3.1 细菌素抗菌活性的测定采用双层琼脂牛津杯法[7],指示菌(金黄色葡萄球菌)菌浓为1×106CFU/mL。通过测定抑菌圈直径大小(mm),表观细菌素抑菌活性。
1.3.2 凝胶原位电泳活性检测参考Schagger的Tricine-SDS-PAGE方法[8],在凝胶两侧平行上样,电泳结束后,将凝胶一分为二。一半用于染色,另一半置于1% Triton X-100溶液中,振荡20min,并水洗2次,去除凝胶中SDS,再以0.1mol/L pH 7.0磷酸钠缓冲液浸泡平衡10min,然后转移至无菌培养皿中,加入20ml含指示菌(菌浓为1×106)LB培养基(含0.7%琼脂,45℃),待其完全凝固后,于37℃培养24h,观察抑菌圈位置。
2 结果和讨论 2.1 菌株的鉴定从高温酒曲中分离得到一株芽孢杆菌PL-2,其发酵液经60%硫酸铵盐析得到的蛋白质溶液,经双层琼脂牛津杯法检测,可显著抑制指示菌生长。PL-2菌株16S rDNA序列比对结果见表 1。
![]() |
表 1 基于菌株PL-2 16S rDNA序列的比对分析 |
经16S rDNA序列比对,LP-2菌株鉴定为Bacillus velezensis,命名为Bacillus velezensis PL-2。
2.2 细菌素的纯化及活性鉴定经高温煮沸、pH沉淀、盐析等步骤,得到纯度较高的蛋白质溶液,然后利用Tricine-SDS-PAGE电泳以及凝胶原位电泳抑菌活性检测方法,检测其纯度和抑菌活性。与Tricine-SDS-PAGE电泳条带相对应的位置处出现指示菌抑菌圈,证明该条带蛋白具有抑菌能力,可初步确定Bacillus.velezensis PL-2产生的抑菌物质为细菌素(蛋白类物质),分子量约10kDa,而非有机酸、过氧化氢等。B.velezensis PL-2发酵液只需经过简单的纯化步骤,即可获得纯度较高的细菌素,有利于后续规模化提取。见图 1。
![]() |
图 1 细菌素的Tricine-SDS-PAGE电泳图和凝胶原位电泳抑菌活性检测图 注:泳道,1, 3-marker,2, 4, 5-纯化的细菌素 |
分别调整细菌素溶液pH并于37℃条件下维持4h,采用双层琼脂牛津杯法,分析其抑菌活性的变化。在pH 3.0~14.0范围内,抑菌活性变化均很小,最大降幅为5%。当pH为2.0时,细菌素发生絮凝沉淀,但沉淀复溶后仍能完全保留其抑菌活性。B.velezensis PL-2生产的细菌素具有宽泛的pH耐受性。见图 2。
![]() |
图 2 细菌素的pH稳定性 |
pH 7.0条件下,分别以不同温度对细菌素进行处理,分析其抑菌活性的变化。分别以30℃~100℃温度处理细菌素溶液,其抑菌活性基本维持不变;110℃、120℃处理30min,均未见蛋白絮凝析出,其抑菌活性仅分别降低10%和18%。B.velezensis PL-2生产的细菌素具有很强的温度耐受性,为其在食品、医药等领域的应用奠定基础。见图 3。
![]() |
图 3 细菌素的热稳定性 |
分别以不同的蛋白酶处理细菌素,以未加蛋白酶的细菌素样品为空白对照,分析蛋白酶对其抑菌活性的影响。目前报道的细菌素中,大部分因不能抵抗蛋白酶K、胃蛋白酶的降解而丧失抑菌活性,而B.velezensis PL-2产的细菌素均能抵御蛋白酶K、胃蛋白酶等5种蛋白酶的水解,保持较高的抑菌活性。因其具有较强的蛋白酶稳定性,可初步判断为一种抗酶解细菌素。见图 4。
![]() |
图 4 细菌素的蛋白酶稳定性 |
采用双层琼脂牛津杯法,分析B.velezensis PL-2生产的细菌素对不同菌属菌株的抑制活性。B.velezensis PL-2生产的细菌素具有广谱抑菌特性,即可抑制革兰氏阴性菌,也可抑制革兰氏阳性菌,对真菌(白色念珠菌、黑曲霉)也具有较强抑制活性,但对大肠杆菌没有抑制作用,有待进一步研究。见表 2。
![]() |
表 2 细菌素抑菌菌谱 |
B.velezensis是芽孢杆菌属一个新种,直至2005年才被报道和正式命名,但其在抑制病原菌和生物防治方面具有显著的优点,已成为关注的焦点。本文中B.velezensis PL-2菌株产生的细菌素分子量约为10kDa,具有贝莱斯芽孢杆菌细菌素共有特性(广谱抗菌特性)。相对于文献报道的B.velezensis菌株产生的细菌素[9-10],该细菌素具有较强的热稳定,可耐受100℃高温,即使在120℃高温下处理30min,其抑菌活性也仅降低18%。此外,该细菌素既可耐受强酸环境,也可耐受强碱的环境,宽泛的pH耐受性也优于目前文献报道的贝莱斯芽孢杆菌细菌素。后续可对该细菌素的生理毒性进行研究,开发其在食品加工、生物医药领域的应用。
志谢:在研究过程中,山东梁山县儒匠酒曲有限公司提供高温酒曲,济宁医学院生物科学实验中心提供实验场所及相关设备,保障了本研究的顺利进行,特此表示感谢。
[1] |
Cotter PD, Ross RP, Hill C, et al. Bacteriocin production:a probiotic trait?[J]. Appl Environ Microbiol, 2011, 78(1): 1-6. DOI:10.1128/AEM.05576-11 |
[2] |
Ahmad V, Khan MS, Jamal, et al. Antimicrobial potential of bacteriocins:in therapy, agriculture and food preservation[J]. Int J Antimicrob Agents, 2017, 49(1): 1-11. DOI:10.1016/j.ijantimicag.2016.08.016 |
[3] |
贾丽艳, 郝林, 段先瑶. 枯草芽孢杆菌HJD.A32产细菌素的生物学特性研究[J]. 中国食品学报, 2013, 13(4): 74-79. |
[4] |
Lee SG, Chang HC. Purification and characterization of mejucin, a new bacteriocin produced by Bacillus subtilis SN7[J]. LWT, 2018, 87: 8-15. DOI:10.1016/j.lwt.2017.08.044 |
[5] |
钱鑫磊, 周珊珊, 张冬乐, 等. 梨树胶孢炭疽病生防菌筛选及其抑菌活性初步评价[J]. 生物学通报, 2017, 52(12): 54-57. |
[6] |
张玉然, 李文平, 郭兰英, 等. 2株酒用酵母的分子鉴定及耐受性研究[J]. 济宁医学院学报, 2016, 39(6): 387-390. DOI:10.3969/j.issn.1000-9760.2016.06.002 |
[7] |
赵玲艳, 邓放明, 杨细平, 等. 生物防腐剂-乳酸菌素[J]. 中国食物与营养, 2005(2): 27-29. DOI:10.3969/j.issn.1006-9577.2005.02.009 |
[8] |
Schagger H, Jagow GV. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa[J]. Anal Biochem, 1987, 166(2): 368-379. DOI:10.1016/0003-2697(87)90587-2 |
[9] |
Perumal V, Yao Z, Kim JA, et al. Purification and characterization of a bacteriocin, BacBS2, produced by Bacillus velezensis BS2 isolated from Meong-ge Jeotgal[J]. J Microbiol Biotechnol, 2019, 29(7): 1033-1042. DOI:10.4014/jmb.1903.03065 |
[10] |
Ye M, Tang X, Yang R, et al. Characteristics and application of a novel species of Bacillus:Bacillus velezensis[J]. ACS Chem Biol, 2018, 13(3): 500-505. DOI:10.1021/acschembio.7b00874 |