2. 山东省科学院生物研究所, 济南 250014
2. Biology Institute, Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014, China
据《本草纲目》记载，硼砂具有清凉解毒、消积块和除痰热等功效，是我国的一味传统中药。硼砂对乳腺癌、食管癌、宫颈癌和阴道癌等具有一定的疗效[1]。但是硼砂对人体具有一定的损伤，进入人体后会与胃酸反应生成硼酸不易排出[2]，易蓄积中毒，表现为头痛、头晕，严重可致死亡[3]。目前，硼砂对大鼠、果蝇、鲫鱼的毒性研究已见报道[4-6]，但是未有其发育毒性方面的研究。
斑马鱼和人类有87%的基因同源性，且在生理功能、发育过程、器官构造等方面与哺乳动物非常接近[7]，同时斑马鱼具有胚胎透明易于观察、给药剂量少和体外受精等特点[8-9]，是理想的模式生物，而且因为减少、替代和优化等动物实验原则，实现保护动物福利和减少哺乳动物等较高级实验动物的使用量，斑马鱼发育毒性实验替代哺乳动物模型已广泛应用于药物的发育毒性与致畸性研究[10-11]。本研究以斑马鱼为研究对象，探讨硼砂对斑马鱼的发育毒性，为硼砂的毒理机制提供科学实验依据。
1 材料和方法 1.1 动物野生型AB品系斑马鱼18条(4月龄)和肝脏转基因T3(lfabp:EGFP)品系斑马鱼18条(4月龄)，由山东省科学院生物研究所斑马鱼药物筛选平台提供。
1.2 试剂与仪器硼砂(中国食品药品检定研究院，批号：190166-201601)，锡纸遮光室温保存，用斑马鱼养殖水溶解稀释，现配现用；三卡因(Sigma公司)，用蒸馏水配制成质量分数为0.16%的溶液，放4℃冰箱保存；斑马鱼养殖水，19.26μg/ml MgSO4、12.67μg/ml KCl、44.4μg/ml CaCl2和292.22μg/ml NaCl[12]。
斑马鱼饲养养殖系统(北京爱生科技有限公司)；光照培养箱HPG280BX(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)；体视荧光显微镜SZX16(Olympus公司)。
1.3 方法 1.3.1 鱼卵收集挑选健康性成熟的野生型AB品系和肝脏转基因T3(lfabp:EGFP)品系斑马鱼按雌雄比例1 :2放入交配缸中，用隔板隔开，16h后抽隔板，2h后即可收集鱼卵，移入盛养殖水的鱼缸中，滴亚甲基蓝溶液，将鱼缸放光照培养箱(温度：28℃；光周期：14h光照，10h黑暗)培养。
1.3.2 发育毒性实验将受精6h的野生型AB品系斑马鱼胚胎在显微镜下观察，将发育正常的胚胎随机转入12孔板中，每孔20个胚胎，3ml不同硼砂浓度的养殖水，每个浓度3个重复孔。硼砂浓度梯度设为0.3mg/ml、0.6mg/ml和0.9mg/ml，不加硼砂的设为空白对照。每日对斑马鱼胚胎或幼鱼进行观察并记录数据，将死亡的胚胎或幼鱼即时清除，以受精后小时(hpf)为时间段，在受精48h更换新的硼砂浓度的养殖水。每天对斑马鱼的自主活动次数、心率、孵化数、畸形数和死亡数进行记录。利用肝脏荧光且发育正常的肝脏转基因T3(lfabp:EGFP)品系斑马鱼幼鱼研究硼砂对肝脏发育的影响，在显微镜下挑选发育72h的健康幼鱼，将其随机转入12孔板中，每孔20个胚胎，3ml不同硼砂浓度的养殖水，每个浓度3个重复孔。硼砂浓度梯度为0.1mg/ml、0.3mg/ml和0.5mg/ml，不加硼砂的设为空白对照。每天将死亡的幼鱼即时清除并在给药后48h更换新的不同硼砂浓度的养殖水。每天用三卡因溶液将斑马鱼幼鱼麻醉，在体视荧光显微镜下对斑马鱼幼鱼进行拍照并观察绿色荧光肝脏面积大小。
1.4 统计学方法斑马鱼幼鱼肝脏面积用软件Image-Pro Plus 5.1进行统计。使用GraphPad Prism 5软件进行数据分析，正态分布计量资料以x±s表示，组间比较采用One-way ANOVA分析，组间两两比较用Tukey检验，P＜0.0167表示有显著性差异。
2 结果 2.1 硼砂对斑马鱼胚胎自主活动的影响斑马鱼胚胎24hpf，随着硼砂浓度的升高斑马鱼胚胎自主活动次数逐渐降低，其中0.9mg/ml硼砂处理组[(1.72±1.99)次/min]斑马鱼胚胎自主活动次数不足空白对照组[(3.94±2.21)次/min]的50%，具有显著性差异(P＜0.01)。见图 1。
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图 1 硼砂对斑马鱼胚胎自主活动的影响 注：与空白对照组相比，*P＜0.01 |
空白对照组48hpf的孵化率为(98.33±2.89)%，硼砂处理组(0.3mg/ml、0.6mg/ml和0.9mg/ml)的胚胎已全部孵化，无统计学差异。空白对照组和硼砂处理组72hpf的斑马鱼胚胎均全部孵化。见图 2。
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图 2 硼砂对斑马鱼胚胎孵化率的影响 |
硼砂各处理组和空白对照组受精48h后的斑马鱼胚胎在心率上无统计学差异；72、96hpf随着硼砂浓度的逐渐升高，斑马鱼幼鱼的心率逐渐降低，硼砂各处理组显著低于空白对照组(P＜0.01)。见图 3。
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图 3 硼砂对斑马鱼幼鱼心率的影响 注：与空白对照组相比，*P＜0.01 |
随着硼砂浓度的升高，96hpf后的斑马鱼胚胎畸形率逐渐上升(图 4)，0.3、0.6mg/ml硼砂处理组与空白对照组在斑马鱼胚胎畸形率上无统计学差异，0.9mg/ml硼砂组斑马鱼幼鱼的畸形率达到了70%(P＜0.01)。斑马鱼幼鱼的畸形主要表现为卵黄囊水肿、心包水肿和脊柱弯曲等症状(图 5)。
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图 4 硼砂对斑马鱼幼鱼畸形率的影响 注：与空白对照组相比，*P＜0.01 |
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图 5 空白对照组和0.9mg/L硼砂组斑马鱼幼鱼在不同时间的发育形态 注：YSE.卵黄囊水肿；PE.心包水肿；SC.脊柱弯曲。 |
硼砂各处理组和空白对照组的斑马鱼胚胎在24、48、72hpf死亡率无统计学差异。0.9mg/ml硼砂组斑马鱼胚胎96hpf死亡率显著性升高(P＜0.01)，达到了50%以上；120hpf死亡率几乎达到了100%(P＜0.01)。见图 6。
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图 6 硼砂暴露对斑马鱼胚胎或幼鱼死亡率的影响 注：与空白对照组相比，*P＜0.01 |
斑马鱼胚胎96hpf，硼砂各处理组和空白对照组肝脏大小无统计学差异，120、144hpf，0.5mg/ml硼砂组斑马鱼肝脏明显小于空白对照组(P＜0.01)。见图 7，8。
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图 7 斑马鱼幼鱼肝脏荧光信号图 |
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图 8 硼砂暴露对斑马鱼幼鱼肝脏的影响 注：与空白对照组相比，*P＜0.01 |
硼砂又叫月石，为硼酸盐类硼砂族矿物，其功效为清热消痰、解毒防腐，常用于治疗咽喉肿痛、口舌生疮、目赤翳障胬肉等。在脊椎动物发育过程中，硼发挥着重要的作用，硼的缺乏会导致妊娠起始和胚胎发育有关的基因下调，导致胚胎发育早期不良。但是高浓度的硼会干扰鸡和大鼠某些器官的发育[13]。在利用斑马鱼模型对硼砂发育毒性进行研究中，斑马鱼胚胎自主活动次数、孵化率、心率、畸形率、畸形形态和死亡率等是重要的评价指标[14]。高剂量硼可降低鸡胸肌肉纤维中葡萄糖、糖原、乳酸和ATP的浓度，破坏肌纤维中线粒体结构，影响其能量代谢[15]。本文结果显示，斑马鱼的自主活动次数随硼砂浓度的升高逐渐降低，硼砂可降低斑马鱼的自主活动次数和心率，增加死亡率和畸形率(心包水肿，卵黄囊水肿和脊柱弯曲)，高浓度的硼砂在受精120h死亡率达到了98.3%，在受精120h和144h后，0.5mg/ml硼砂处理组斑马鱼肝脏明显小于空白对照组，提示高浓度的硼砂可能破坏斑马鱼体内的能量代谢，这与鸡中的研究结果一致。此外，高剂量的硼可能引起细胞浑浊肿胀[16]，而斑马鱼的畸形是以卵黄囊水肿和心包水肿为主。硼诱发Gcn2激酶催化eIF2α的磷酸化，干扰翻译的起始，导致蛋白质合成的抑制作用[17]。因此，斑马鱼心脏和肝脏等器官的发育受到了抑制。
综上所述，高浓度的硼砂在斑马鱼发育过程中会减少其自主活动次数，增加其畸形率和死亡率，同时抑制心脏和肝脏的发育，具有发育毒性，但是当硼砂浓度低于0.3 mg/ml时对斑马鱼发育几乎没有影响，可以作为其安全浓度。在未来，需要进一步对硼砂毒性作用靶点进行分析，确定其毒性机理，为其进一步的应用奠定理论基础。
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