肾癌是泌尿系统最常见的肿瘤之一,大约占人类恶性肿瘤的3%。近年来,肾癌患病率逐年增高,且人群呈年轻化趋势。由于肾癌对放化疗皆不敏感,外科手术已成为治疗肾癌的主要手段,但对于转移性和高危肾癌患者的治疗效果仍不理想。肾癌中透明细胞癌作为最常见的类型,大约占肾癌的80%。目前,关于肾透明细胞癌的侵袭和转移的治疗依然面临许多困难。因此,透明细胞癌的靶向治疗可能为提高肾癌预后带来新的希望。
miR-34a是受肿瘤抑制基因p53调控的具有肿瘤抑制作用的miRNA,对肿瘤细胞周期阻滞、凋亡、细胞生长抑制以及肿瘤干细胞抑制等发挥重要作用[1-2]。本研究通过病毒感染肾透明细胞癌细胞769-P,过表达其miR-34a水平,探讨miR-34a对769-P细胞增殖、迁移能力及细胞周期等生物学行为的影响,为研究肾透明细胞癌靶向治疗提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料人肾癌细胞株769-P、786-O、ACHN、OSRC来源于西安交通大学泌尿外科研究所,慢病毒载体miR-NC和miR-34a由上海吉玛制药技术有限公司合成,RMPI1640培养基购自Gbico公司,胎牛血清购自Hyclone公司,PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit、SYBR Premix Ex TaqII购自TaKaRa公司,Trizol试剂及miR-34a实时定量PCR引物购自北京天根生化科技有限公司,细胞周期检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所,Transwell小室(孔径8μm)购自MILLIPORE公司。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养及分组人肾癌细胞株769-P、786-O、ACHN、OSRC用含10%胎牛血清的RMPI1640培养基,在37℃、5%CO2恒温孵育箱中培养,细胞对数生长期传代。将对照载体与miR-34a表达慢病毒载体感染769-P,建立稳定表达空载体(NC)与miR-34a的细胞株,实验分为空白对照组、NC组、miR-34a组。
1.2.2 转染实验取对数生长期769-P细胞传代,接种于6孔培养板,每孔接种2~3×105个/ml 769-P细胞,待细胞密度约70%时,取慢病毒滴度液NC和miR-34a 10μl和20μl感染细胞,并加入polybrene增加感染效率。24h后弃去慢病毒培养液换成正常培养液。倒置荧光显微镜观察绿色荧光检测感染效率。
1.2.3 qRT-PCR提取细胞总RNA。反转录成cDNA,反应体系20μl。PCR反应以U6RNA为内参,其引物为U6-forward 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’和U6-reverse 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’, miR-34a实时定量PCR引物序列为miR-34a-forward 5’-TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGT-3’和miR-34a-reverse 5’-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3’。实时荧光定量PCR仪进行PCR扩增及分析,设置3个复孔,独立重复实验3次。
1.2.4 细胞增殖实验将空白对照组、NC组及miR-34a组对数期生长细胞用胰酶消化,培养基稀释成5×105个/ml,取4块96孔板,分别标记0、24、48、72h,每组细胞设置6个复孔。Gen5酶标仪检测490nm下吸光度值,并依据结果制作生长曲线,抑制率(IR)计算:(1-miR-34a组/空白对照组)×100%,独立重复实验3次。
1.2.5 Transwell迁移实验取空白对照组、NC组及miR-34a组对数生长期细胞200μl/组接种于Transwell(8μm)上室,下室加入800μl 10%胎牛血清RMPI1640培养基,每组细胞设置3个复室,置于37℃培养箱孵育24h,固定染色,显微镜下随机取5个视野计数并拍照。
1.2.6 细胞周期实验将空白对照组、NC组及miR-34a组对数期生长细胞用加入预冷的70%乙醇,置于4℃固定过夜,离心并PBS洗涤后加入含50μg/ml溴化乙锭(PI)、100μg/ml RNase A、0.2% Triton X-100的500μl PBS,4℃避光环境下孵育30min,流式细胞仪检测各组细胞周期。
1.3 统计学方法应用统计学软件SPSS17.0进行双向方差分析和双尾t检验,得到的数据用x±s表示,双尾t检验水准以P < 0.025为统计学差异有统计学意义。
2 结果 2.1 miR-34a在各肾癌细胞株中相对表达水平选取4种人肾癌细胞株769-P、786-O、ACHN、OSRC进行实验,其中769-P细胞miR-34a表达量在4种肾癌细胞株中最低(图 1),因此,选取肾透明细胞癌细胞株769-P作为研究对象,观察过表达miR-34a后769-P细胞生物学行为的改变。
过表达miR-34a后,miR-34a组细胞增殖能力降低,在48h、72h增殖明显受到抑制(P < 0.025)。见图 2。
miR-34a组与空白对照组及NC组细胞相比,穿膜细胞数目明显减少(P < 0.025)。3组迁出细胞数分别为:(382.18±37.84)、(398.57±24.09)和(103.73±17.36)个。见图 3。
空白对照组、NC组和miR-34a组S期细胞比例分别为(37.31±2.12)%, (35.96±1.78)%,(57.24±2.67)%,miR-34a组S期细胞比例比另两组显著升高(P < 0.025),表明miR-34a可将769-P细胞周期阻滞于S期。见图 4
目前,关于透明细胞癌的侵袭和转移的治疗依然面临许多困难,也是肾癌致死的主要原因之一。治疗肾癌的主要方法是手术治疗,但针对肾癌的辅助治疗和靶向治疗也日益受到推崇,这可能是未来研究的主要方向[3]。
miR-34a作为肿瘤抑制物在人类多种肿瘤组织和细胞中低表达[4-5]。与正常邻近肾脏组织相比,80%肾癌组织中miR-34a显著下调[6]。肿瘤细胞的增殖在很大程度上破坏了正常细胞组织,从而促进肿瘤的进展。目前miR-34a在肿瘤中失调的机制仍未明确。很多证据表明CpG甲基化导致的转录沉默在肿瘤抑制基因失活过程中发挥作用,同时可能促进细胞具有选择优势的克隆生长[7]。本文结果显示过表达miR-34a显著抑制769-P细胞的增殖,提示miR-34a有可能成为肾透明细胞癌治疗的新靶点。
肿瘤细胞的恶性程度与其本身迁移能力的强弱有一定的关系,细胞的迁移能力受多种细胞信号通路的介导,miR-34a可通过靶向调节多种致癌基因,如c-Met、Bcl-2、E2F3、Notch1等介导调节细胞的侵袭和迁移,从而发挥抑癌作用[8]。本文结果显示miR-34a对肾癌细胞株769-P细胞的迁移有明显抑制作用,由此推测,miR-34a可通过靶向多种癌基因参与了抑制769-P细胞迁移的作用。
细胞周期的调控也是恶性肿瘤的生物学特征之一,细胞周期依赖激酶和细胞周期蛋白在G1/S期、G2/M期及S期起到了关键作用[9],本实验通过miR-34a过表达建立稳定感染的细胞株,发现miR-34a组S期的细胞比例显著高于空白对照组,表明miR-34a可通过诱导细胞周期停止在S期,发挥抑制细胞增殖的作用。
综上所述,miR-34a转染肾癌769-P细胞可抑制其增殖、迁移,可为肾癌的基因治疗提供新的思路。
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