苹果多酚(apple polyphenols，AP)是苹果中所含多元酚类物质的总称，具有清除自由基、抗氧化、降血压等多种生物学功能[1]。AP可通过抑制血管紧张素转换酶来降低血压[2], 缓解和减少高血压以及心肌缺血过程中的氧化应激和炎症[3]，改善血管内皮功能，降低血中胆固醇，具有抗动脉粥样硬化的作用[4-6]。经常吃苹果可使心脏病的发病率降低13%~22%[7]。本研究以蟾蜍为实验对象，在离体和在体两个水平观测AP对于心脏活动的影响，并探讨其作用机制。
1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 动物健康蟾蜍，体重80~100g，雌雄不限，由济宁医学院日照校区实验动物中心提供。在体研究中，蟾蜍分为对照组和实验组，每组8只；离体水平研究中，每组5~8只，制备离体蛙心，用于灌流实验。
1.1.2 主要试剂AP干粉由东北林业大学王振宇教授惠赠，纯度约70%[8]；盐酸肾上腺素注射液(上海禾丰制药有限公司)。所用其他试剂均为分析纯，包括NaCl、KCl、无水CaCl2、NaHCO3、NaH2PO4和葡萄糖。蛙心灌流所用任氏液6种，无钙任氏液和5种不同钙离子浓度的任氏液(CaCl2浓度分别为0.06、0.12、0.18、0.24和0.30mg/ml)。其中含有0.12mg/ml CaCl2的任氏液为正常钙离子浓度任氏液(正常任氏液)。用正常任氏液将AP干粉配制成100mg/ml的原液，分装后置于-20℃冻存，实验前将AP原液配稀释成不同浓度的灌流液。
1.1.3 仪器FT-100生物张力换能器、蛙心插管、BL-420F生物机能实验系统购自成都泰盟科技有限公司。其他实验用品均由济宁医学院药学院综合实验室提供。
1.2 方法 1.2.1 在体心搏曲线记录法记录蟾蜍在体心搏曲线[9]，待曲线稳定后，采用大腿淋巴囊注射给药的方式研究AP对心脏活动的影响。对照组注射正常任氏液100μl；实验组注射100mg/ml AP液100μl。比较两组给药后3min和6min的心率以及心肌收缩力变化。
1.2.2 离体蛙心灌流法采用斯氏法制备离体蛙心标本[9]。为保证曲线的稳定性，我们对传统蛙心灌流法进行改进[10]。蛙心离体后每3min更换1次正常任氏液，待收缩曲线稳定后进行药物灌流实验，为观察AP对肾上腺素作用的影响，采用以下灌流方案。对照灌流组，首先更换新鲜正常任氏液，观察正常曲线1min，然后换入含0.1μg/ml肾上腺素的灌流液，观察效应2min；实验灌流组采用药物预孵育的方式，先用含AP(0.5mg/ml或1mg/ml)的灌流液预孵育1min，再换入含有0.1μg/ml肾上腺素和AP的灌流液，观察2min。为观察灌流液中钙离子浓度对AP作用的影响，采用以下灌流方案：首先，用正常任氏液进行灌流。曲线稳定后，加入含有特定浓度CaCl2的任氏液，待曲线稳定后(约1min)，再加入1mg/ml AP灌流液，观察2min。观察效应完毕后，均更换3~4次正常任氏液，每次间隔1min，待曲线恢复到正常水平进行下一组灌流观察[10-11]。
1.3 统计学方法实验数据属于正态分布，以x±s表示。采用PRISM 8.0软件进行统计学分析。两组多个时间点的比较，首先采用重复测量资料的方差分析进行比较，然后选用Sidak's multiple comparisons test对两组同一时间点进行两两比较。多组之间比较采用单因素方差分析，然后选用Tukey's multiple comparisons test进行两两比较。
2 结果 2.1 在体条件下AP对心脏活动的影响淋巴囊注射给药后，实验组蟾蜍心肌收缩力下降幅度大于对照组，差异具有统计学意义(F=10.11，P=0.0067)；不同时间点的心肌收缩力差异有统计学意义(F=59.39，P < 0.001)；AP对心肌收缩力的抑制作用随时间发生改变(F=50.34, P < 0.001)。与对照组相比，实验组蟾蜍的心肌收缩力在AP注射后第3min和第6min均显著降低，而心率没有显著性变化。见图 1、表 1。
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图 1 在体条件下AP对蟾蜍心率和心肌收缩力的影响 注：图为蟾蜍在体心搏曲线，曲线分两段，给药前和给药后。组别如图所示，A对照组，注射正常任氏液100μl；B实验组，注射100mg/ml AP 100μl。 |
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表 1 在体条件下AP对蟾蜍心率和心肌收缩力的影响(n=8) |
AP在离体水平也可以显著降低心肌收缩力(见图 2)。0.125mg/ml AP对心肌收缩力没有明显影响；0.25mg/ml、0.5mg/ml和1mg/ml AP均使心肌收缩力显著降低(见表 2)。计算给药前后的差值，对不同浓度AP的负性肌力作用进行比较，结果显示不同浓度AP对心肌收缩力的抑制作用不同(F=63.41，P < 0.001)，其作用随浓度增加而增强(见表 2)。此外，实验中发现2 mg/ml AP可以引起心脏收缩骤停(图 2E)。值得注意的是AP的抑制作用可以通过换洗消除，三次换洗后心肌收缩力可以恢复到正常水平，甚至高于正常水平。这说明，AP对心肌收缩力的抑制作用不是由于急性损伤导致的。
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图 2 不同浓度AP对蟾蜍心肌收缩力的影响 注：图为蛙心灌流心搏曲线，A-E来自同一只蟾蜍，灌流液中AP浓度如图所示。每组灌流曲线分为3段，给药前、给药后以及换洗恢复阶段。 |
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表 2 不同浓度AP对蟾蜍心肌收缩力的影响(n=8) |
1mg/ml AP可以降低蟾蜍心肌收缩力(F=26.22，P=0.0005)；孵育时间不同，AP对心肌收缩力的抑制作用也有差异(F=210.20，P < 0.001)；AP的负性肌力作用随孵育时间的延长发生改变(F=464.90, P < 0.001)。与对照组相比，1mg/ml AP在第1min已经使心肌收缩力略有下降，无统计学差异；在第3、5、7min AP均表现出显著的负性肌力作用；不同时间点，AP对心肌收缩力的抑制作用不同(F=55.18，P < 0.001)，且其抑制作随时间延长而增加。见图 3、表 3。
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图 3 AP对心肌收缩力的抑制作用与时间的关系 注：图为蛙心灌流心搏曲线，A, B来自同一只蟾蜍，组别如图所示；每组灌流曲线分为两段，给药前和给药后。 |
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表 3 1mg/ml AP在不同孵育时间对心肌收缩力的抑制作用(n=6) |
与给药前相比，0.1μg/ml AD、0.1μg/ml AD+0.5mg/ml AP和0.1μg/ml AD+1mg/ml AP 3个组均可以使心肌收缩力明显增强，但是在0.5mg/ml和1mg/ml AP存在的条件下，AD的正性肌力作用显著降低。见图 4、表 4。
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图 4 AP对肾上腺素刺激条件下心肌收缩力的影响 注：图为蛙心灌流心搏曲线，A、B、C来自同一只蟾蜍，灌流组别如图所示。每组灌流曲线分为4段，给药前、预孵育、给药后以及换洗恢复阶段。 |
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表 4 AP抑制肾上腺素刺激引起的心肌收缩力增强(n=6) |
我们进一步观察灌流液中钙离子浓度对AP负性肌力作用的影响。将正常灌流液更换为无钙任氏液后，心肌收缩幅度很小，此时AP对心肌收缩力抑制作用微弱；灌流液中CaCl2浓度范围在0.06~0.30mg/ml时，1mg/ml AP均能降低心肌收缩力(见图 5)。AP给药前后心肌收缩力变化显著(F=965.78，P < 0.001)，不同钙离子灌流液条件下心肌收缩力有差异(F=236.27，P < 0.001)，AP对心肌收缩力的抑制作用随灌流液中钙离子浓度的变化而改变(F=48.99，P < 0.001)。计算不同钙离子浓度灌流条件下给药前后的差值后进行比较，结果显示AP对心肌收缩力的抑制作用随着钙离子浓度的增加而增强(见表 5)。
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图 5 灌流液中钙离子浓度对AP抑制作用的影响 注：图为蛙心灌流心搏曲线，A-F来自同一只蟾蜍，灌流液中CaCl2浓度如图所示，AP均为1mg/ml；每组灌流曲线分为3段，正常灌流，特定钙离子浓度任氏液灌流，特定钙离子浓度任氏液+AP灌流阶段。 |
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表 5 灌流液中钙离子浓度对AP抑制心肌收缩力的影响(n=5) |
AP是一种非常安全的功能性食品[12]，具有良好的抗氧化性和抗炎作用[3-4, 7]，其对于心脏的保护作用受到国内外广泛关注。苹果提取物可以降低小鼠血清中胆固醇、低密度脂蛋白和甘油三酯的含量，增加高密度脂蛋白，增强血液的抗氧化活性，从而减少心血管疾病的发生[5]。苹果类黄酮可以扩张血管，降低血压，具有预防心血管疾病的作用[6]。国内文献报道，AP可以通过抗氧化和减少性粒细胞浸润发挥对缺血-再灌注后心肌的保护作用[13]。这些研究表明，AP可以通过扩张血管、降血压、抗氧化、抑制炎症等作用对心脏发挥保护作用。但是AP对心脏的直接影响却鲜有报道。
本文以蟾蜍为实验对象，在离体和在体两个水平研究AP对于心脏的直接作用。在体的研究结果表明，AP可以显著抑制蟾蜍心肌收缩力，但对心率无明显影响；离体水平的研究结果显示，AP可呈剂量和时间依赖性抑制正常条件下的心肌收缩力，并可显著拮抗肾上腺素的正性肌力作用。这提示AP抑制心肌收缩力的作用可能与抑制β受体有关。交感神经系统兴奋时，血中肾上腺素和去甲肾上腺素增加，作用于心脏β1受体引起心肌收缩力增强，升高血压。本文结果显示AP可以抑制肾上腺素刺激引起的心肌收缩力增强，这提示AP可能通过抑制心肌收缩力发挥降低血压的作用。此外，心脏β1受体过度激动会诱发心肌缺血和损伤，AP可能通过抑制心肌收缩力避免心肌过度劳累，从而发挥对心脏的保护作用。
钙离子是心肌细胞电活动和机械活动的关键离子，本文结果显示，AP对心肌收缩力的抑制效果随灌流液中钙离子浓度增加而增强。这提示AP对心肌收缩力的抑制作用具有钙离子依赖性。研究还发现，AP可以抵消或者部分抵消高钙引起的心肌收缩力增强，这说明AP对心肌收缩力的抑制作用与抑制钙离子内流有关。钙超载是引起心肌缺血—再灌注损害的重要机制之一。心肌细胞内大量Ca2+累积，会影响线粒体氧化磷酸化过程，导致细胞能量代谢障碍[12]。本文结果提示，AP可能通过抑制钙离子内流，防止心肌细胞钙超载，发挥心脏保护作用。
综上所述，本文首次发现AP可以显著降低正常以及肾上腺素刺激条件蟾蜍心肌收缩力，其作用具有钙离子依赖性，可能与抑制β受体和钙离子内流有关。
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