柯萨奇病毒B3(CVB3)是单正链RNA病毒，属于肠道病毒，小RNA病毒科，基因组序列全长约7.4kb，有开放读码框架一个。一旦感染本病毒，即会在宿主体内进行大量复制，造成溶细胞性感染，可导致宿主很快出现大量的细胞损伤死亡。CVB3可引发多种疾病，如肝炎、干燥综合征、胰腺炎、病毒性心肌炎^[1-2]、扩张型心肌病^[3]、无菌性脑膜炎等疾病^[4]。目前应用的各种防治方法均未起到满意效果，需要进一步探究更加安全的、效果更好的防治策略。

RNA干扰(RNA interference, RNAi)近年来在抗病毒研究领域展现了巨大的潜力。siRNA对很多种病毒的抑制效果均比较理想^[5-7]，针对siRNA抑制CVB3复制的研究目前也有很多团队在进行，有研究证实VP1区^[8]、2A区^[9]、3C区^[10]、3D区^[11]均可以设计出有效的siRNA序列，Kim等^[12]已证实2C区的CRE部位是设计siRNA序列的有效靶点。

本文将设计的siRNA序列转染入HeLa细胞，筛选抑制效果好的siRNA序列，同时探究2C区CRE以外的基因是否可以设计CVB3特异性较高的siRNA序列。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 病毒和细胞

HeLa细胞由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所细胞中心提供。CVB3 H3株是用包含CVB3基因全长的感染性克隆PMSK-1质粒^[13](登录号U57056)转染入细胞后获得^[14]，该病毒是由哈尔滨医科大学的钟照华教授馈赠，将其在HeLa细胞中活化，滴定该病毒滴度为10⁸TCID50/ml。

1.1.2 主要试剂和仪器

EntransterTM-R转染试剂购自英格恩生物公司；荧光定量PCR试剂盒Premix Ex Taq TM(DRR039)由宝生物工程有限公司销售提供；LEICA-HC荧光显微镜购自Leica公司。

1.2 方法 1.2.1 病毒TCID50滴定

在96孔的细胞培养板中接种HeLa细胞，密度为5×10⁴个细胞/孔，将细胞培养12h后，进行病毒50%组织培养感染剂量(50% Tissue culture infective dose, TCID50)的滴定。稀释病毒，其浓度依次为1×10¹、1×10²、1×10³、1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰，各取100μL分别加入96孔板中，每个稀释度进行了8个重复，第11列和12列为对照，每天在显微镜下观察细胞的病变(cytopathic effect, CPE)，记录结果，直至CPE的终点出现。该过程要保证设置的对照组始终保持正常的形态和特征。用Reed-Muench法计算本病毒的TCID50/ml。

1.2.2 siRNA的设计、合成和标记

CVB3基因序列在GenBank中已登录，其登录号为U57056，按照Elbashir等^[15]及Reynolds^[16]的设计原则，在CVB3的3D、3C、2C、2A、VP3、VP2和VP1区设计了siRNA序列共计11条，分别命名为siRNA1-11。增设了用FAM标记的无关siRNA序列设置为阴性对照组siRNA-NC，阳性对照组siRNA-PC选取往年发已表验证的抑制效率较高的siRNA序列^[10]。13条siRNA制备合成时3′端均设计了dTdT悬突(序列见表 1)。合成的siRNA序列是干粉状，将其融入DEPC水中，稀释至终浓度为20μM，存于-20℃备用。

1.2.3 确定最佳转染条件

将FAM标记的阴性对照序列siRNA-NC稀释浓度分别为200nM、、150nM和100nM，EntransterTM-R(μL)：siRNA(μg)设为4 :2和5 :2，HeLa细胞接到细胞培养板中用不含抗生素的DMEM营养液进行培养，待细胞达到40%左右的融合度时进行siRNA转染，转染siRNA 12h后通过荧光显微镜及流式细胞术技术观察筛选最适宜的转染siRNA的条件。

1.2.4 转染siRNA后感染CVB3

将浓度为150nM的siRNA和Entranster TM-R按照2 :5的比例进行混合后转染入HeLa细胞。本次实验共分16组，siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4、siRNA-5、siRNA-6、siRNA-7、siRNA-8、siRNA-9、siRNA-10、siRNA-11组分别转染相应的siRNA序列，siRNA-PC为转染阳性对照组，siRNA-NC为转染阴性对照组，mock为仅加转染试剂Entranster TM-R组，virus only组为HeLa细胞未转染任何物质组。于转染后12h在以上15组HeLa细胞上分别感染0.01MOI的CVB3，sham infected是正常细胞对照组，未转染siRNA和未感染病毒。于病毒感染HeLa细胞36h后收获目的细胞和病毒，检测siRNA对病毒复制的抑制效果。

1.2.5 MTT法检测抑制效率

收获16个观察组的目的细胞，分别加入MTT液培养4h，弃去培养液上清分别加入二甲基亚砜，在酶联免疫检测仪A490nm处测量各孔的吸光值。sham infected是正常细胞对照组，将其细胞的活率设定为100%，分别计算各组细胞的存活率。

1.2.6 Real-time RT-PCR检测抑制效率

收获目的细胞和病毒采用实时荧光定量RT-PCR进行检测，选取β-actin为内参，将siRNA-NC处理组设置为calibrate定为1，通过相对定量方法，检测设计的11条siRNA序列对CVB3复制的抑制情况。

1.2.7 Western blot检测VP1蛋白表达变化

收获目的细胞，处理后样品按20μl/孔上样，分别用β-actin单克隆抗体(1 :5000)和VP1蛋白特异性的多克隆抗体(1 :1000)37℃孵育1h，洗膜后分别加入辣根(HRP)标记的山羊抗鼠IgG二抗和山羊抗兔IgG二抗，孵育处理后，扫膜仪扫膜。

1.2.8 毒价滴定检测病毒抑制率

HeLa细胞转染13条siRNA序列12h后感染CVB3，感染病毒36h后收获HeLa细胞，滴定病毒液上清TCID₅₀值。

1.3 统计学方法

采用SPSS22.0统计学软件进行数据分析，定量资料用x±s表示，组间比较采用ANOVA，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 转染率的测定

在倒置荧光显微镜下观察不同浓度下siRNA-NC的转染率，发现siRNA染率在浓度为200nM和150nM时较高。流式细胞检测结果显示当siRNA浓度为150nM，EntransterTM-R(μL):siRNA(μg)=5 :2时，siRNA转染的效率最好，确定此时为最佳转染条件(图 1)。

2.2 siRNA在细胞病变方面对CVB3的抑制

siRNA并感染病毒36h后HeLa细胞的病变情况，发现三个对照组siRNA-NC、mock和virus only中大部分的HeLa细胞均已出现病变。siRNA-1、siRNA-2、siRNA-6三组细胞病变情况与阴性对照组相似，基本未表现出保护效果。siRNA-5组病变最少，siRNA-8和siRNA-4组病变次之(见图 2)。与倒置显微镜下观察的细胞病变结果相似，MTT法检测结果显示三个对照组mock、siRNA-NC、virus only和siRNA-1、siRNA-2、siRNA-6处理组中细胞死亡率高达80%，而其它组细胞的死亡率排序依次为：siRNA-11＞siRNA-10＞siRNA-9＞siRNA-3＞siRNA-4＞siRNA-8＞siRNA-5。因siRNA-1、siRNA-2、siRNA-6三组siRNA未表现出保护效果，故在此处淘汰此三组，后期不再进行检测和实验。所有数据进行了三个重复实验，三次重复之间进行比较，*P < 0.05，**P < 0.01。

2.3 RNA水平上siRNA对CVB3病毒的抑制

Real-time PCR方法结果显示siRNA-5对病毒的抑制率最高，为84%，siRNA-8次之，为82%，siRNA-11最低仅为28%。siRNA-PC、siRNA-3、siRNA-4、、siRNA-9和siRNA-10分别为：62%、72%、80%、72%和63%。所有数据进行了三个重复实验，三次重复之间进行比较，*P < 0.05，**P < 0.01(图 3)。

2.4 蛋白水平上检测siRNA对CVB3的抑制

VP1蛋白的特异性条带出现在所有感染CVB3的细胞组中，三个对照组virus only、mock和siRNA-NC处理的HeLa细胞中VP1蛋白表达的量相差不大，均较多。但siRNA-5、siRNA-8、siRNA-4处理的HeLa细胞中VP1蛋白的量明显减少。所有数据进行了三个重复实验，三次重复之间进行比较，*P < 0.05，**P < 0.01。见图 4。

2.5 siRNA处理后CVB3毒价的变化

毒价滴定结果显示，siRNA-11对病毒的抑制率最低，与siRNA-NC相比，CVB3的毒价只降低了0.7log10。其中siRNA-5的抑制率最高，CVB3的毒价下降了2log10。与MTT、CPE、Western blot和real-time PCR结果相吻合，siRNA对CVB3的抑制率依是：siRNA-5＞siRNA-8＞siRNA-4＞siRNA-3＞siRNA-9＞siRNA-10＞siRNA-11(见图 5)。所有数据进行了三个重复实验，三次重复之间进行比较，*P < 0.05，**P < 0.01。

3 讨论

柯萨奇病毒B3呈球形，直径约22~30nm，为单股正链RNA，全长由7396个碱基组成，具有mRNA活性和感染性^[17]。依功能分区为5′端非编码区(5′-untranslated region，5′-UTR)、P1区、P2区、P3区、3′端非编码区(3′-UTR)和一个Poly(A)尾，CVB3可以引起很多疾病，至今尚无有效治疗手段。部分研究表明，在哺乳类细胞，甚至人类细胞中导入21~23个核苷酸(nucleotide, nt)的短双链RNA(small interfering RNA, siRNA)可使靶向基因的表达产生明显的特异性强抑制效应，而且不会诱发免疫反应和细胞毒性，因此siRNA应用于临床治疗成为可能^[18]。

CRE对病毒复制是必不可缺的，在CVB3基因组中3’-UTR区、5’-UTR区和2C区各有一个CRE存在。研究发现一旦病毒的CRE遭到破坏，其在宿主体内的复制将会受到严重影响，因3’-UTR区和5’-UTR区不是设计siRNA的适宜靶点，故很多研究选取2C区的CRE为靶点进行研究。Merl等^[11]的研究已证实在EV71和CAV24两种病毒中在其基因序列中的2C区CRE部分设计的siRNA序列有效的沉默了这两种病毒的致病性。然而针对CVB3目前仅有Kim等^[12]组成的团队在其2C区的CRE部分发现了一条沉默效率较高的siRNA靶序列，那么在CVB3基因组中2C区CRE以外的部分是否是设计siRNA的有效靶点迄今为止没有任何研究证实。为此，本研究设计了siRNA-5和siRNA-6两条siRNA序列，它们均以2C区CRE以外的基因序列为靶点。本文结果显示本次筛选的11条siRNA序列中，siRNA-5对CVB3的抑制率最高，其沉默效率高达84%，经siRNA-5处理的HeLa细胞组其细胞活率达到了86%。首次证实验证了CVB3基因组中2C区CRE以外的部分也是设计siRNA的有效靶点。

部分研究发现针以2A区为靶点设计的siRNA序列对病毒的沉默效率较高^[11]。本研究设计的siRNA-3以2A区为靶点，其对CVB3的沉默效率达到了72%。但本研究中以2C区为靶点设计的siRNA-5对CVB3的沉默效率远远高于在2A区设计的siRNA-3，因此，本研究团队推测CVB3基因组中2A区可能并非是设计siRNA靶序列最理想的区域。

本文发现了5条新的siRNA靶序列，它们对CVB3的沉默效率均较高，同时首次证实了2C区CRE以外的部分也是设计siRNA的理想靶点。本研究为防治CVB3感染引起的病毒性疾病提供了新的靶点和策略。