肺腺癌患者Breg Treg与IL-10 IL-35的表达及相关性研究

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文洁, 蒋胜华, 王娴玮, 山凤莲. 肺腺癌患者Breg Treg与IL-10 IL-35的表达及相关性研究[J]. 济宁医学院学报, 2019, 42(5): 363-367, 371. DOI: 10.3969/j.issn.1000-9760.2019.05.013.

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WEN Jie, JIANG Shenghua, WANG Xianwei, SHAN Fenglian. Expression and correlation of Breg Treg and IL-10 and IL-35 in lung adenocarcinoma patients[J]. Journal Of Jining Medical University, 2019, 42(5): 363-367, 371. DOI: 10.3969/j.issn.1000-9760.2019.05.013.

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基金项目

济宁医学院教师扶持基金课题（JYFC2018FKJ075）；济宁医学院附属医院"苗圃"科研课题面上项目（2017-MP-MS-013）

通信作者

山凤莲, 女, E-mail:shanfenglian@126.com;

文章历史

收稿日期：2019-06-15

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肺腺癌患者Breg Treg与IL-10 IL-35的表达及相关性研究

文洁¹ , 蒋胜华² , 王娴玮² , 山凤莲²

1. 济宁医学院临床医学院, 济宁 272013;
2. 济宁医学院附属医院, 济宁 272029

收稿日期：2019-06-15

基金项目：济宁医学院教师扶持基金课题（JYFC2018FKJ075）；济宁医学院附属医院"苗圃"科研课题面上项目（2017-MP-MS-013）

通信作者：山凤莲, 女, E-mail:shanfenglian@126.com.

摘要：目的经流式细胞仪分析肺腺癌患者外周血CD4⁺CD25^hi Tregs及其亚群包括aTreg、non-Treg、rTreg以及CD19⁺CD24^hi CD27^hi Bregs水平，探讨两群细胞及相应细胞因子IL-10、IL-35间的表达关系及临床意义。方法选20例EGFR阳性并采用厄洛替尼方案治疗的肺腺癌患者为病例组，选30例年龄和性别与其相匹配的健康体检者为对照组。用流式细胞仪检测CD4⁺CD25^hi Tregs细胞及其亚群（rTreg、non-Treg、aTreg）、CD19⁺CD24^hi CD27^hi Bregs细胞水平，采用酶联免疫吸附反应检测IL-10及IL-35的表达水平，比较肺腺癌患者与健康人群Treg、Breg、IL-10及IL-35的表达水平，并行相关性分析。结果病例组Treg和Breg水平显著高于对照组（P < 0.05）；其中aTreg占CD4⁺ T淋巴细胞的比例较对照组升高（P < 0.05）。病例组治疗后Treg及Breg水平均较治疗前降低，但无统计学差异。相关性分析提示肺腺癌患者外周血中Breg与Treg呈正相关（r=0.513），IL-10与Treg和Breg呈正相关（r=0.637；r=0.791）。IL-35与Treg和Breg呈正相关（r=0.496；r=0.553）。结论肺腺癌患者体内存在Breg与Treg细胞及其相关细胞因子IL-10、IL-35表达异常，推测它们共同参与免疫失衡，促进肿瘤发展。临床上可通过动态监测上述指标表达水平，利于实时评估非小细胞肺癌患者的免疫状态。

关键词：调节性T细胞/Treg细胞调节性B细胞/Breg细胞 IL-10 IL-35 肺腺癌

Expression and correlation of Breg Treg and IL-10 and IL-35 in lung adenocarcinoma patients

WEN Jie¹ , JIANG Shenghua² , WANG Xianwei² , SHAN Fenglian²

1. School of Clinical Medicine, Jining Medical University, Jining 272013, China;
2. Affiliated Hospital of Jining Medical University, Jining 272029, China

Abstract: Objective Flow cytometry was used to analyze the levels of CD4⁺CD25^hi Tregs and its subgroups including aTreg, non-Treg and rTreg and CD19⁺CD24^hi CD27^hi Bregs in peripheral blood of lung adenocarcinoma patients, and to explore the expression relationship and clinical significance between the two groups of cells and corresponding cytokines. Methods Twenty patients with lung adenocarcinoma who were EGFR positive and treated with erlotinib were selected as the case group, and 30 healthy subjects whose age and sex matched with the case group patients were selected as the control group.Flow cytometry was used to detect the levels of CD4⁺CD25^hi Tregs cells and their subsets(rTreg, non-Treg, aTreg), and CD19⁺CD24^hi CD27^hi Bregs cells.Enzyme Linked Immune Sorbent Assay was used to detect the expression levels of IL-10 and IL-35.The expression levels of Treg, Breg, IL-10 and IL-35 were compared between lung adenocarcinoma patients and healthy people, and the parallel correlation analysis was carried out. Results The levels of Treg and Breg in the case group were significantly higher than those in the control group(P < 0.05).The proportion of aTreg in CD4⁺ T lymphocytes was higher than that in the control group(P < 0.05).The Treg and Breg cell levels in the case group before treatment were higher than those after treatment(P>0.05).The Treg and Breg levels of patients after targeted therapy were lower than those before treatment(P>0.05).Correlation analysis showed that Breg was positively correlated with Treg in peripheral blood of lung adenocarcinoma patients(r=0.513, P < 0.05), and IL-10 was positively correlated with Treg and Breg(r=0.637, P < 0.05;r=0.791, P < 0.05).IL-35 was positively correlated with Treg and Breg(r=0.496, P < 0.05;r=0.553, P < 0.05). Conclusion Abnormal expression of Breg and Treg cells and their related cytokines IL-10 and IL-35 exist in lung adenocarcinoma patients.It is presumed that they jointly participate in immune imbalance and promote tumor development.Clinically, the immune status of patients with non-small cell lung cancer can be evaluated in real time by dynamically monitoring the expression level of the above indicators.

Keywords: Regulatory T cells/Treg Regulatory B cells/Breg IL-10 IL-35 Lung adenocarcinoma

肺癌是癌症相关死亡的主要原因之一，其中大多数死因为肺癌复发、转移。肺癌相关死亡率高的主要原因之一是肺癌患者对化疗的耐药性和获得性耐药性^[1]。因此，必须继续努力开发更有效的诊断和治疗替代方案来治疗肺癌患者。免疫监测和免疫耐受的不平衡是肿瘤形成的基本因素。近年来，随着肿瘤免疫学研究的进展，免疫疗法越来越成为非小细胞肺癌的一种新的治疗方法。调节性B细胞(regulatory B cell, Breg)及调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)作为免疫系统内淋巴细胞中有着免疫负性调节功能的亚群，他们不仅在维持机体免疫平衡方面有重要作用，也与肿瘤的存活、增殖和转移密切相关。目前有关Treg、Breg的免疫功能研究也较为深入，但对Breg与肿瘤的发生发展的相关性研究多集中在卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、肝癌、结直肠癌等中，目前研究认为Treg、Breg均可能通过产生具有负性免疫调节功能的细胞因子如TNF-β、IL-10等来发挥负向免疫调节作用，本研究以Breg、Treg为研究切入点，通过流式细胞仪分析肺腺癌患者外周血Treg及其亚群包括rTreg、non-Treg和aTreg以及Breg水平，应用双抗体夹心酶联免疫吸附(ELISA)法测定其血浆中IL-10和IL-35水平，以期为肿瘤的治疗和预防提供新思路及相关理论依据。

1 资料与方法 1.1 一般资料

收集2017年9月-2018年9月在济宁医学院附属医院呼吸内科初治的肺腺癌患者20例。年龄在38~75岁，中位年龄57岁; 其中男8例，女12例。纳入标准:经病理学确诊为肺腺癌且基因检测为EGFR阳性的患者，且采用2002年美国联合癌症分类委员会(AJCC)分期标准行TNM分期，选取TNM分期为ⅢB期11例和Ⅳ期9例；所有病例均未患其他肿瘤或免疫相关性疾病，且在本次研究前3个月内未使用激素类或免疫抑制类药物。病例组患者经靶向药物厄洛替尼治疗的标准方案治疗，疗效评价采用RESIST标准标准。健康对照组30例均来自本院体检中心2017年9月-2018年9月健康体检志愿者，其中男性15例，女性15例，年龄35 ~ 70岁，中位年龄57岁；均无糖尿病、风湿性疾病、甲状腺功能亢进等自身免疫性疾病及免疫治疗史。以上所有纳入的研究对象均知情同意且该研究经济宁医学院附属医院伦理委员会批准同意。

1.2 主要仪器与试剂

鼠抗人FITC-IgGl、鼠抗人PE-IgGl、鼠抗人APC-IgGl、鼠抗人CD4-FITC、鼠抗人CD25-PE、鼠抗人CD45RA-PE、鼠抗人CD19-FITC、鼠抗人CD24-PE、鼠抗人CD27-APC单克隆抗体试剂；溶血素；抗人IL-10、IL-35 ELISA试剂盒；流式细胞仪、酶标仪、台式离心机、低温高速离心机均购自美国BD公司。

1.3 方法 1.3.1 标本采集及保存

肺腺癌患者于确诊后第2天清晨采集空腹状态下(禁食≥8h)肘正中静脉血5ml用EDTA抗凝管存储。健康对照组在体检中心采集空腹(禁食≥8h)肘正中静脉血5ml，分装于EDTA抗凝管。其中病例组患经者靶向治疗3月后再采血一次，分别在门诊随访时采集空腹(禁食≥8h)肘正中静脉血5ml于EDTA抗凝管。所有血标本4℃冰箱冷藏保存，2h内完成标本处理。

1.3.2 标本处理

1) 流式细胞仪检测两组外周静脉血CD4⁺CD25⁺ Tregs及其亚群、CD19⁺CD24^hiCD27^hi Bregs的数量：1)准备数个标记好的Falcon流式管。然后取已采好病例组患者及健康对照者EDTA抗凝管中外周静脉血100μl；2)测Tregs及其亚群时各管分别加入鼠抗人CD4-FITC抗体、鼠抗人CD25-PE抗体、鼠抗人CD45RA-PE抗体及同型对照各20μl，测Bregs时相应各管分别加入鼠抗人CD19-FITC抗体、鼠抗人CD24-PE抗体、鼠抗人CD27-APC抗体及同型对照各20μl。3)加入抗体后充分震匀，室温下避光孵育15min；然后各管加入1ml溶血素，充分震匀，避光孵育6min；然后200g离心5min；结束后弃上清，加1ml PBS并震荡均匀后于200g离心5min后洗涤；各管加500μl PBS将细胞重悬并充分震匀；使用流式细胞仪计数细胞后检测Tregs及其亚群、Bregs数量。

2) 细胞采集及分析：用Cell quest软件分析CD4⁺、CD19⁺细胞群，然后再分别圈出CD25^hi的细胞群(CD4⁺CD25^hi T细胞)、CD25^hi且CD45RA^hi的细胞亚群(CD4⁺CD25^hi CD45RA^hi T细胞)、CD25^hi且CD45RA^low的细胞亚群(CD4⁺CD25^hi CD45RA^low T细胞)和CD24^hi、CD27^hi的细胞群(CD19⁺CD24^hiCD27^hi B细胞)；计数细胞个数。结果分别以百分比(%)表示。

1.3.3 血浆IL-10、IL-35浓度测定

取已采好病例组患者及健康对照者对应EDTA抗凝管中静脉血约2~3ml，30min内分离血浆，1500r/min离心10min，用移液枪将血浆移至EP管中，编号并保存于-70℃冰箱备用。采用双抗体夹心酶联免疫吸附法测定血浆中IL-10、IL-35浓度。

1.4 统计学方法

研究数据采用SPSS 21.0统计软件对两组资料进行分析；计量资料满足正态分布时以x±s表示，两组间采用独立样本t检验分析。组内采用配对设计的t检验分析，相关分析两变量满足正态分布时采用Perason直线相关分析，以P＞0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 CD4⁺CD25⁺ Tregs及其亚群、CD19⁺CD24^hi CD27^hi Bregs、IL-10及IL-35表达水平结果比较

通过标记CD4、CD25、CD45RA将CD4⁺ Treg细胞分成三亚群，检测两组受试者外周血Treg表达水平。结果以各类细胞占外周血T淋巴细胞的百分比表示，病例组外周血中CD4⁺CD25⁺ Treg水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05。图 1A、B；表 1)。而rTreg及non-Treg在两组中无明显差异(P＞0.05)，而病例组aTreg(CD4⁺CD25⁺CD45RA⁺ Treg细胞)水平较对照组明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05。表 1，图 1E)。病例组患者外周血CD24、CD27标记的Breg细胞占CD19⁺ B淋巴细的比例较对照组显著升高(P＜0.05。图 1C、D；表 1)。同时，病例组外周血中IL-10及IL-35水平显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表 1。

图 1 流式细胞学检测肺腺癌患者及健康对照外周血Breg, Treg及其亚群的表达注：1)CD4⁺CD25⁺Treg对照组(图A)，病例组治疗前(图B)；2)CD19⁺CD24^hiCD27⁺ Breg对照组(图C)，病例组治疗前(图D)；3)病例组aTregs(CD45RA^- CD25*)治疗前(图E)；治疗后(图F); 4)病例组CD19⁺CD24^hiCD27⁺ Breg治疗后(图G)

表 1 两组间CD4⁺CD25⁺ Tregs及其亚群、CD19⁺CD24^hiCD27^hi Bregs、IL-10及IL-35表达情况比较(x±s)

2.2 病例组靶向治疗前后外周血Treg及Breg、IL-10及IL-35水平分析

病例组20例经厄洛替尼靶向方案治疗的腺癌患者，于治疗1个月后复查，根据WHO实体肿瘤化疗效果评价标准评价结果为19例有效(PR，SD)，1例进展。经3月治疗后再次复查采血，结果显示CD4⁺CD25⁺ Treg水平较前有所下降，其3个亚群aTreg、rTreg及non-Treg均有下降趋势，但与治疗前比较无统计学意义(P＞0.05)；Breg水平较前亦有下降趋势，但差异无统计学意义(P＞0.05)。见图 1F、G；表 2。

表 2 病例组靶向治疗前与靶向治疗后CD4⁺CD25⁺ Tregs及其亚群、CD19⁺CD24^hiCD27^hi Bregs、IL-10及IL-35表达情况比较(x±s)

2.3 Treg、Breg、IL-10及IL-35的相关性分析

病例组患者外周血中Breg与Treg呈正相关, IL-10与Treg和Breg呈正相关。IL-35与Treg和Breg呈正相关。IL-10与IL-35呈正相关。见表 3。

表 3 Treg、Breg、IL-10及IL-35的相关系数矩阵

3 讨论

近年来，随着抗细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)单抗、PD-1、PD-L1单抗药物的不断研发，肿瘤免疫治疗是继靶向治疗后，成为当下肿瘤的研究热点，成为我们未来能够用来治疗肿瘤的一个新领域。

机体抗肿瘤免疫以细胞免疫为主，机体的免疫功能状态在肿瘤的发病及治疗中起着重要的作用。肺癌患者体内往往都存在不同程度的免疫抑制，Breg、Treg等免疫细胞作为肿瘤微环境的重要负性调节成分，介导免疫抑制^[2-3]。既往研究报道，在肺癌患者外周血、肿瘤局部微环境中，Treg的比例显著增加，对其进行剔除后或进行“抗原封闭”阻断其抑制功能，能够加强人体的抗肿瘤免疫功能^[4-5]。Miyara等^[6]将Treg分为活动状态Treg细胞(aTreg)、静息状态Treg细胞(rTreg)和分泌性Treg(non-Treg)3个亚群，其中rTreg和aTreg占主要部分且起主要抑制作用，目前多种肿瘤疾病中发现rTreg，non-Treg，aTreg 3个亚群表达水平的异常，且差异与相应的疾病其所处阶段有关。同样，目前研究已证实了Breg与肿瘤的发生、发展与转移的关系。在胃癌、胰腺癌、宫颈癌、肝癌等许多相关研究中均可观察到Breg的异常升高。经肿瘤切除或其他处理后，Breg数量有显著下降^[7-9]。目前研究认为Breg细胞在肿瘤免疫中发挥作用的机制主要有两个方面。一方面，Breg细胞通过分泌IL-10影响CD4⁺T及CD8⁺T细胞的功能及数量，从而降低肿瘤抑制性细胞因子的产生、抑制淋巴细胞的抗肿瘤免疫。另一方面，Breg细胞通过分泌TGF-β、共刺激分子诱导Treg细胞产生，并增强Treg细胞的抑制肿瘤免疫功能。本研究结果显示，相对对照组，病例组患者外周血CD19⁺CD24^hi Breg及CD4⁺CD25⁺Treg表达比例显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。Treg的3类亚群中aTreg水平病例组明显高于对照组(P＜0.05)，rTreg和non-Treg没有差异性(P＞0.05)。经RESIST标准评价有效的患者有19例，另有1例为进展。检测20例病例组患者治疗后外周血中Treg及其亚群和Breg总体水平较治疗前有下降趋势。这与上述研究结果一致。相关性分析显示，CD19⁺CD24^hi Breg水平与CD4⁺CD25⁺Treg水平呈正相关(r=0.513)，提示在肺癌患者体内两类细胞存在相互影响关系，共同参与肺癌的负性免疫，并能反映肺癌患者的免疫状态，这与Xing等^[10]报道一致。晚期肿瘤患者体内免疫功能通常处于严重抑制状态，肺癌患者体内Treg、Breg升高的幅度与其分期呈正相关，治疗后二者数量明显下降^[11]，且与出现淋巴结转移的发生率相关^[4]，因此，我们推测病例组患者体内的Treg、Breg变化在评估治疗的有效性方面可能有一定的价值，具体检测有待进一步研究。

IL-10、IL-35主要是由Treg及Breg细胞的某些特定亚型分泌的抑制性调节因子。IL-10主要通过作用于不同的免疫细胞，如Th1细胞、单核-巨噬细胞等，介导免疫抑制，使其产生相关细胞因子或抑制某些分子的表达，介导体内抗肿瘤免疫抑制，从而使机体出现细胞增殖失控、免疫逃逸^[11-15]。L-35与IL-10相似，并且在肿瘤微环境中IL-35可与Breg细胞互相诱导表达，导致肿瘤的免疫应答反应受抑制。因此，在肿瘤中IL-10、IL-35的异常升高，均可导致肿瘤的增殖失控，对肿瘤的发生发展起重要作用^[16]。本研究显示肺腺癌患者外周血中IL-10、IL-35明显升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。相关性分析显示IL-10与Treg、Breg均呈正相关(r=0.637, r=0.791)，IL-35与Treg、Breg亦均呈正相关(r=0.496, r=0.553)，提示肺癌患者体内IL-10、IL-35等抑制性细胞因子水平可异常升高，共同抑制肺癌患者体内抗肿瘤反应，这些抑制性细胞因子与Treg、Breg共同促进肺癌的发生及进展。因此，临床上可通过动态监测上述指标表达水平，利于评估肺腺癌患者的免疫状态。

总之，机体抗肿瘤免疫机制十分复杂，多种细胞因子及免疫细胞通过各种相互间的作用，调控着机体内复杂且庞大的免疫功能调控网络。目前，免疫治疗的重点是打破肿瘤微环境中具有负性免疫调节功能细胞及相关细胞因子间的异常联系，明确肿瘤微环境中的免疫抑制细胞与抑制性细胞因子之间的相关性，可为非小细胞肺癌免疫治疗提供新思路。此外，针对这些抑制性细胞因子或者Treg、Breg细胞的免疫治疗药物的开发，有望为肺癌患者的治疗提供更多的治疗选择。

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