酪氨酸酶是含铜原子的多功能氧化酶,主要介导黑色素前体多巴醌的合成[1]。酪氨酸酶催化活性的异常升高会诱发雀斑、黄褐斑等色素沉着症状[2]。通过抑制酪氨酸酶活性可有效减轻色素沉着。目前,应用较广泛的酪氨酸酶抑制剂有曲酸、氢醌、熊果苷等[3-6],但由于存在稳定性差、安全性低及抑制强度弱等问题,寻找新型结构抑制剂已成为该领域的研究热点。
二乙基二硫代氨基甲酸钠(sodium diethyldithiocarbamate,DDTC),与铜离子络合显色,可用于可溶性铜的定量[7],其金属螯合物能阻止癌细胞转移和细胞外基质降解[8-9]。本文以L-酪氨酸和左旋多巴为底物,测定了8种二硫代氨基甲酸类化合物对酪氨酸酶的抑制作用,初步探究了此类化合物的抑制机理。
1 材料与方法 1.1 试剂与仪器酪氨酸酶(Worthington化学有限公司);3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物(MBTH)和曲酸(上海萨恩化学技术有限公司);3, 4-二羟基-L-苯基丙氨酸和L-酪氨酸(天津希恩思生化科技有限公司);二甲基二硫代氨基甲酸钠(1)、甲基哌啶二硫代甲酸甲基哌啶盐(2)、1-吡咯烷二硫代甲酸铵(3)、六甲烯二硫代氨基甲酸六甲基铵盐(4)、二苄基二硫代氨基甲酸钠(5)、一硫化四甲基秋兰姆(6)、二硫化四乙基秋兰姆(7)和二乙基二硫代氨基甲酸钠(DDTC),均购于梯希爱(上海)化成工业发展有限公司。实验所用试剂均为分析纯,实验用水为自制超纯水。结构式如图 1。
DNM-9602G酶标分析仪(北京普朗新技术有限公司);TB-215D电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);恒温振荡金属浴(上海一恒科学仪器有限公司);KQ-500DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);XW-80A微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)。
1.2 方法 1.2.1 化合物对酪氨酸酶活性的抑制作用检测酪氨酸酶催化活性的测定方法在文献[10]的方法基础上做了少许调整,即在磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中,以1.0mmol/L的L-tyrosine或L-dopa为底物,利用其反应生成的中间产物能与MBTH结合,生成的粉红色结合产物在492nm处有最大吸收,通过在酶标仪中测定492nm处的吸光度进行酪氨酸酶的活性定量。以L-tyrosine的羟化反应作为单酚酶活性,以L-dopa的氧化反应作为二酚酶活性。将8种化合物分别溶于DMSO中,配成1.0mmol/L的初始浓度,然后稀释成不同浓度(500.0、200.0、100.0、50.0、10.0、5.0、2.0、1.0和0.1μmol/L)添加到反应体系中,于恒温振荡金属浴中(37℃)孵育10min后,移入96孔板并置于酶标仪中记录492nm波长处的吸光度A。各化合物对酪氨酸酶的抑制作用通过下式计算:
抑制率%=[(A2-A4)-(A1-A3)]/(A2-A4)×100%
式中,A1为同时加化合物和酶的反应体系的吸光度,A2为加酶不加化合物的吸光度,A3为只加化合物不加酶的吸光度,A4为未加化合物和酶的吸光度。数据经拟合后抑制率为50%时对应的化合物浓度即该样品的IC50值。
1.2.2 抑制机理考察及单酚酶抑制类型判断通过系列浓度化合物对4种不同浓度(5.4、10.7、16.1及21.4μg/ml)酪氨酸酶催化底物氧化活力的影响来判断其抑制机理,即根据抑制剂分子与酶的反应活性中心以非共价或是共价方式结合,考察抑制作用是不可逆抑制(irreversible inhibition)还是可逆抑制(reversible inhibition)。当采用相对残余活性对酶浓度作图,如果得到一组均通过原点的直线,则为可逆抑制过程。另外,通过改变底物L-dopa的浓度和化合物浓度,并采用Lineweaver-Burk双倒数作图对其单酚酶抑制类型进行判断。
1.2.3 金属离子对抑制作用的影响检测由于二硫代氨基甲酸类化合物能与铜离子等金属离子发生络合作用,考察金属离子与化合物共存时对其抑制作用的影响。采用去离子水配制硫酸铜、硫酸锌和三氯化铁溶液,浓度为10.0mmol/L和2.0mmol/L,将其加入反应体系中与酶和化合物作用5min,然后按照1.2.1酪氨酸酶活性评价部分进行余下操作。分别在1 :1、1 :0.2和1 :0摩尔比条件下考察了金属离子对抑制活性的影响。
2 结果与讨论 2.1 DDTC的抑制作用迄今为止,已报道的酪氨酸酶抑制剂分子中仅少数几种能够用于美白产品中,其中,曲酸和氢醌的应用最为广泛。我们将二硫代氨基甲酸类的代表性化合物DDTC与曲酸和氢醌对二酚酶的抑制作用做了比较(图 2)。结果发现DDTC具有较好的二酚酶抑制作用,随着剂量增加,残余酶活力逐渐下降,拟合得到的半数抑制浓度(IC50)值为23.7μmol/L,当浓度>100.0μmol/L时可获得完全的酶抑制作用(抑制率>95%)。曲酸抑制效力约为DDTC的1/6,其IC50值约为138.3μmol/L,当曲酸浓度达到5.2mmol/L以上才可获得最大抑制率(94.8%)。在此条件下,氢醌是酪氨酸酶的不良抑制剂,IC50值比DDTC和曲酸高了2~3个数量级,约为10.1mmol/L。
进一步考察不同浓度DDTC下蘑菇酪氨酸酶氧化L-tyrosine的进程,见图 3。L-tyrosine作为底物测定酪氨酸酶的单酚酶活性时,492nm下吸光度随时间变化存在一个显著的滞后期,这是单酚酶活性的特征。通过将产物积累曲线的线性部分外推至横坐标来估计滞后期。由横坐标截距可知,该滞后时间随DDTC浓度的增加而逐渐增大,从0μmol/L的4.7min增加到1.5μmol/L时的10.1min。当反应体系达到稳定状态后,产物累加曲线随反应时间的增加呈线性增加,直线斜率表示稳态速率,由图 3示稳态速率也受DDTC加入量的影响,随着抑制剂浓度的增加,稳态速率明显下降且呈剂量依赖性。通过将反应速率与抑制剂浓度非线性拟合,得其单酚酶抑制活性的IC50值为1.1μmol/L。此结果表明,DDTC能够有效抑制酪氨酸的单酚酶活性,不仅可以降低酶的稳态速率,还可以有效延长产物生成的滞后时间。
通过对酶残余活性和抑制剂浓度的非线性拟合,得到二硫代氨基甲酸类分子对酪氨酸酶的单酚酶和二酚酶活性抑制作用的IC50值(图 4和表 1)。以L-tyrosine和L-dopa作为测定单酚酶和二酚酶活性的底物。所有二硫代氨基甲酸分子对单酚酶和二酚酶活性均显示抑制作用,且呈剂量依赖性。其中化合物1~5对双酚酶活性IC50值分别为5.4、67.7、12.7、6.9和178.0μmol/L;化合物1、3、4和DDTC对单酚酶活性IC50值分别为0.2、0.06、0.2和1.1μmol/L(由于化合物2和5具有较差的二酚酶抑制活性,没有进一步进行其单酚酶抑制作用的考察)。
化合物1、3、4显示出比其他化合物更强的酪氨酸酶抑制活性,而化合物2和5的抑制活性相对较差,这表明在硫原子周围引入的烷基或芳香基团所产生的空间位阻效应对抑制活性的提高是不利的。此外,如果结构中带负电的硫原子形成类似酸酐的单硫化物(化合物6)或通过二硫键形成二硫化物(化合物7)也都展现出较差的抑制活性(IC50>1000.0μmol/L)。
2.3 抑制作用机制判断考察4个浓度的化合物对不同浓度的酶催化活性的抑制作用,见图 5。图示,将4个浓度酶对应的催化活性相连可得到均过原点的直线。随着添加酶浓度的增加,单位时间内产物的生成量随之增加,而相同酶浓度下加入的抑制剂分子的量越多,单位时间产物的生成量则越少。最终确定,化合物1、3、4和DDTC对酪氨酸酶的抑制作用均为可逆抑制。将不同抑制剂浓度下的反应速率和底物浓度进行双倒数作图,得到了数条相交于y轴的直线(图 6),表明化合物的抑制类型为竞争型抑制,拟合得到的抑制常数Ki值见表 1。
二硫代氨基甲酸盐是一些金属离子的良好螯合剂,有报道称这类分子与Mn2+、Zn2+或Cu2+等离子络合后可作为有效的杀虫剂,DDTC与Cu2+络合后在体内显示出更强的抗肿瘤活性[11]。研究化合物1、3、4和DDTC与Cu2+、Fe3+和Zn2+等离子络合前后对酪氨酸酶抑制作用强度的变化。见图 7。发现Cu2+与化合物达到1 :1摩尔比时,对几种化合物的抑制作用显示出较为明显的减弱效应,而Fe3+无论在哪个浓度下对它们的抑制作用影响都不大,Zn2+在高浓度时对化合物4和DDTC的抑制效应减弱较为明显,而对化合物1和3的抑制作用影响不大。这可能与不同结构化合物与金属离子络合作用的强弱有关,同一种金属离子对化合物的弱化效应则受金属离子与化合物摩尔比的影响。
本文测定了8种二硫代氨基甲酸类化合物对蘑菇酪氨酸酶的单酚酶和二酚酶活力的抑制作用,结果表明这类结构的分子是酪氨酸酶的良好抑制剂。对单酚酶抑制效应最强的化合物3,IC50为0.06μmol/L,对二酚酶抑制效应最强的化合物1,IC50为5.4μmol/L。其中,能与酶催化位点的铜原子发生络合作用的带电硫醇基团是发挥抑制效应的必需基团。当在硫原子周围引入甲基或苄基等具有明显空间位阻效应的官能团,或者当化合物与Cu2+、Zn2+络合后,抑制活性均有显著下降。总之,作为一类有效的酪氨酸酶抑制剂,二硫代氨基甲酸盐经进一步的分子结构优化后,可成为治疗色素沉着性皮肤病的潜在候选物。
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