2. 济宁医学院附属济宁市第一人民医院, 济宁 272011;
3. 济宁医学院临床医学院, 济宁 272013
2. Jining No.1 People's Hospital & the Affiliated Hospital of Jining Medical University, Jining 272011, China;
3. College of Clinical Medicine, Jining Medical University, Jining 272013, China
糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropath，DPN)是糖尿病的常见并发症，严重降低糖尿病患者的生活质量。DPN主要累及双下肢的进展性痛觉过敏[1]。背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)作为初级感觉传入神经元聚集的部位，是疼痛信号传递的关键途径[2]。越来越多的证据表明，DRG初级感觉神经元的兴奋性增强引起DPN中疼痛信号的产生[3]。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)通常在一些小型和中型DRG神经元中表达和合成，并且可以从DRG释放以支持神经元发育或参与疼痛感知[4]。BDNF主要与存在于大型和中型DRG神经元的高亲和力受体即酪氨酸激酶受体B(TrkB)结合[5]。研究显示在糖尿病大鼠的DRG中BDNF表达升高[6]，并且抗BDNF抗体可以使糖尿病大鼠DRG神经元中电压门控钾电流密度下降的状态趋向正常[7]。目前，尚无报道BDNF是否以及如何调节在DPN进展过程中DRG神经元的兴奋性。本研究采用链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)建立DPN大鼠模型，探讨外源性BDNF对DPN大鼠痛觉过敏作用及其机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试剂与仪器STZ、BDNF、TrkBFc、多聚赖氨酸均购自美国Sigma公司；TRIZOL、胶原酶、胎牛血清购自美国Invitrogen公司；BCA蛋白测定试剂盒购自上海碧云天生物技术公司；兔抗BDNF单克隆IgG、兔抗TrkB单克隆IgG购自美国Abcam公司；山羊抗兔IgG-HRP、山羊抗小鼠IgG-HRP购自美国Sahta Craz Biutechholgg公司；荧光化学成像仪购自瑞士Bucher Biotec公司；Epc-9放大器和Patch-master软件购自德国HEKA公司。
1.1.2 实验动物和导管植入雄性Wistar大鼠(10周龄，实验开始时体重200~250g)购自山东省实验动物中心。腹腹腔注射3%戊巴比妥钠(1ml/kg体重)麻醉大鼠。无菌条件下于大鼠腰部L6和骶骨S1椎骨之间的间隙做一切口，将无菌聚乙烯导管(PE-10, 长15.0cm，购自美国Instech Laboratories Incorporation公司)通过切口插入蛛网膜下腔，导管的尖端固定在L4腰椎水平，导管末端由皮下穿行至大鼠颈部固定。通过鞘内注射10μl 12%利多卡因来确认导管放置位置。只有在利多卡因注射后30s内出现后爪可逆性麻痹的大鼠视为成功插入导管。
1.2 方法 1.2.1 DNP大鼠模型的建立禁食12h后，成功插入导管的大鼠一次性腹腔注射STZ(55mg/kg新鲜溶解于0.1mol/L柠檬酸缓冲液，pH4.5)。3d后每周检测1次尾静脉血糖浓度。只有在整个实验过程中血糖浓度≥20mmol/L的大鼠作为DNP模型大鼠。
1.2.2 动物分组和鞘内给药将BDNF和TrkB Fc以最终浓度的1000倍溶于二甲基亚砜(DMSO)中，并分装冻存。在使用前将储存液在无菌0.9%氯化钠溶液中稀释。STZ注射后3d，将48只糖尿病大鼠随机分成3组(n=16)，并且给予不同药物6周：TrkB组(在BDNF 5μg/20μl/d鞘内给药前30min给予TrkB Fc 5μg/20μl/d)，BDNF组(BDNF 5μg/20μl/d鞘内给药)和DPN组(DMSO 0.022μg/20μl/d鞘内给药)在最后一次鞘内给药后第6天测试机械痛觉阈值和热痛觉阈值。
1.2.3 机械痛觉和热痛觉阈值测定采用单育法行为测试。使用Von Frey纤维和热痛仪分别测量左右后爪对机械和热刺激的阈值。采用一系列标准von Frey纤维刺激大鼠后爪的足底中间区域，压力足以使细丝弯曲5s，被测试后爪的快速撤回视为阳性反应。根据文献方法[8]计算50%爪回缩阈值。采用对热刺激的缩足阈值来评价热痛觉过敏。将大鼠置于恒温30℃的薄玻璃平台上。用由高强度灯泡(10W)产生加热速率0.95℃/s的加热灯来加热目标后爪。记录从热刺激开始直到后爪回缩的时间。设定30s的自动终止时间以防止后爪受到损伤。
1.2.4 DRG组织收集完成行为测试后，通过腹腔注射3%戊巴比妥钠(1ml/kg)麻醉并处死动物。从每只动物中取出双侧L4-6 DRG。将来自每组8只大鼠一侧的DRG用于实时定量PCR，另一侧的DRG用于蛋白印迹测定。分离每组8只大鼠两侧的DRG，用于膜片钳记录。
1.2.5 BDNF和TrkB mRNA表达检测用TRIzol提取来自DRG组织的总RNA。使用cDNA合成试剂盒进行逆转录。由上海生工生物工程有限公司设计并合成引物(表 1)。使用Maxima SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒在iQ5实时定量PCR检测系统上进行实时定量PCR。计算循环阈值(Ct)值，并使用2-ΔΔCt方法相对于内参GAPDH的水平计算BDNF和TrkB基因的标准化表达水平。
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表 1 引物序列 |
将DRG组织匀浆后提取蛋白，并使用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。将含有50μg蛋白质的样品加载到10%SDS凝胶上，通过电泳分离并转移到硝酸纤维素(NC)膜上。用兔抗BDNF单克隆IgG(1 :1000)，兔抗TrkB单克隆IgG(1 :2000)和小鼠抗β-actin单克隆IgG(1 :1000)分别在水平摇床上4℃孵育膜12h。洗膜后分别用相应的二抗即山羊抗兔IgG-HRP(1 :2000)或山羊抗小鼠IgG-HRP(1 :3000)孵育膜2h。使用化学发光检测试剂盒在荧光化学成像仪中显现免疫反应性条带。BDNF和TrkB的蛋白表达水平用与β-actin的光密度比率表示。
1.2.7 细胞培养和膜片钳记录在无菌条件下取出大鼠的DRG组织，用0.5%胰蛋白酶和1%胶原酶消化DRG 1h，分解成单细胞。将细胞重悬于由10%胎牛血清组成的DMEM / F-12培养液中并置于含有多聚赖氨酸(0.1mg/ml)预包被的玻璃盖玻片上，保存在37℃ 5%CO2培养箱中，在接种24h内进行记录。使用EPC-9放大器和Patch-master软件进行全细胞电压钳记录。用电阻4MΩ至6MΩ的玻璃微电极与细胞建立高阻(1GΩ~10GΩ)封接。本研究均选取小直径(膜电容≤20pF)的DRG神经元进行兴奋性测定。电极内液成分(mmol/L)为：140 KCl，4 NaCl，10 HEPES，10 EGTA，0.5 CaCl2，1 MgCl2，用KOH调节pH 7.4。细胞外液成分(mmol/L)为：140 NaCl，5 KCl，1.8 CaCl2，1 MgCl2，10 HEPES，10 Glucose，用NaOH调节pH 7.4。将细胞保持在0pA，记录静息电位(resting membrane potential，RMP)。通过施加一系列持续5ms的去极化电流(从0pA开始以每次增加10pA的幅度逐渐升高)来触发第1个动作电位(action potential, AP)以测量阈电流强度。通过施加一持续较长时间的去极化电流(阈电流强度的2倍，持续1s)以触发细胞产生连续AP，计数AP的频率。
1.3 统计学方法计量资料数据以x±s表示，采用SPSS19.0软件统计分析，数据均符合正态分布且方差齐，用单因素方差分析组间差异，然后用Student-Newman-Keuls进行各组间的两两比较。P＜0.05为差异具有显著性。
2 结果 2.1 一般情况观察3组大鼠体重改变值和血糖改变值比较分析，注射BDNF和TrkB Fc对体重血糖的影响不大。见表 2。
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表 2 3组间体重改变值及血糖改变值比较(x±s) |
3组大鼠机械痛觉阈值(F值=57.0，P＜0.05)及热痛觉阈值(F值=22.1，P＜0.05)存在统计学差异。相较于鞘内注射DMSO溶剂的DPN大鼠，鞘内注射BDNF可以升高机械痛觉阈值和热痛觉阈值，表现出一定的镇痛作用。预先给予TrkB Fc可以阻断BDNF对机械痛觉阈值(P＜0.05)和热痛觉阈值(P＜0.05)的效应。见图 1。
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图 1 各组大鼠机械痛觉和热痛觉阈值比较 注：A为机械痛觉阈值(n=16)；B为热痛觉阈值(n=16)；与DPN组相比，*P＜0.05；与BDNF组相比，#P＜0.05 |
实时定量PCR结果显示，鞘内注射BDNF和TrkB Fc对DPN大鼠的BDNF mRNA(F值=2.5，P＞0.05)和TrkB mRNA(F值=0.58，P＞0.05)表达无显著影响。见图 2。与BDNF和TrkB mRNA表达结果类似，鞘内注射BDNF和TrkB Fc对DPN大鼠的BDNF蛋白(F值=0.31，P＞0.05)和TrkB蛋白(F值=0.23，P＞0.05)表达无显著影响。见图 3。
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图 2
各组大鼠DRG组织BDNF和TrkB mRNA表达
注：A为BDNF mRNA表达统计图(n=8); B为TrkB mRNA表达统计图(n=8) |
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图 3
各组大鼠DRG组织BDNF和TrkB蛋白表达
注：A1为BDNF及β-actin蛋白条带 A2为BDNF蛋白表达统计图(n=8) B1为TrkB及β-actin蛋白条带 B2为TrkB蛋白表达统计图(n=8) |
3组大鼠DRG神经元的RMP(F值=9.5，P＜0.05)、阈电流水平(F值=16.4，P＜0.05)及AP频率(F值=18.2，P＜0.05)存在统计学差异。鞘内注射BDNF可以降低DPN大鼠的DRG神经元兴奋性，表现为RMP向超极化方向偏移(P＜0.05)，阈电流水平升高(P＜0.05)，以及AP频率降低(P＜0.05)。预先应用TrkB Fc可阻断BDNF对RMP(P＜0.05)、阈电流水平及AP频率(P＜0.05)的效应。见图 4、图 5。
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图 4 各组大鼠DRG神经元静息电位、阈电流 注：A为一个小直径DRG神经元(膜电容16.8pF)记录到的单个动作电位及刺激电流。B为DRG神经元静息电位统计图(n=24分别来自各组的8只动物)。C为DRG神经元阈电流统计图(n=24分别来自各组的8只动物)。与DPN组相比，*P＜0.05；与BDNF组相比，#P＜0.05 |
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图 5 各组大鼠DRG神经元动作电位频率 注：A为一个小直径DRG神经元(膜电容18.5pF)记录到的单个动作电位及刺激电流。B为DRG神经元动作电位频率统计图(n=24分别来自各组的8只动物)与DPN组相比，*P＜0.05；与BDNF组相比，#P＜0.05 |
DPN以周围神经系统结构和功能改变为主要特点，随着病程进展，损害逐渐加重，症状由初期的痛觉过敏进展为感觉缺失，是导致糖尿病患者截肢的重要原因。由于发病机制不明，除严格控制血糖外，缺乏有效治疗药物。糖尿病神经病变早期，初级感觉神经元的兴奋性增强，引起机械痛觉和热痛觉阈值的下降[9-10]，即通常状态不产生伤害性信号的刺激出现过度反应，动物实验表现出痛觉行为。BDNF通过TrkB在DRG的初级感觉神经元中发挥神经调节作用以控制疼痛信号传导，本实验采用向DPN大鼠鞘内注射BDNF的方式，证实BDNF减轻了糖尿病神经病变的痛觉过敏症状。
一般认为感受伤害性刺激的神经元(主要为小直径的DRG神经元)的静息电位通常维持在超极化状态，需要较强的去极化电流才可以产生动作电位，因此只有较强的(具有潜在损害的)机械、热或化学刺激才能使感受伤害性刺激的神经元兴奋。在本实验中，DPN大鼠的DRG神经元兴奋性较强，表现为RMP向去极化方向偏移，诱发出第1个动作电位的阈电流强度较低，动作电位频率较高。同时DPN大鼠对机械刺激和热刺激的缩足阈值较低。电生理实验结果与行为实验结果均与以往的研究[9-10]相符。
BDNF参与生理状态下的疼痛调节[11-12]，并且在不同的疼痛模型中发挥作用，如炎症引起的痛觉过敏[13]，完全弗氏佐剂引起的热痛觉过敏[14]，L5前根切断模型的机械性痛觉过敏[15]和脊髓神经结扎模型的痛觉过敏[16]。以往的研究显示，外源性BDNF可以降低正常大鼠的DRG神经元中电压门控钾电流密度，抗BDNF抗体可以使糖尿病大鼠DRG神经元中电压门控钾电流密度下降的现象趋向正常[7]。本文结果显示连续鞘内注射BDNF 6周显著升高DNP大鼠的机械痛觉和热痛觉阈值，并且降低了DNP大鼠DRG神经元的兴奋性，表现为RMP向去极化方向偏移，诱发出第1个动作电位的阈电流强度下降，动作电位频率升高。提示BDNF通过降低DNP大鼠DRG神经元的兴奋性起到减轻机械痛觉和热痛觉过敏的作用。BDNF的以上效应均可以被预先给予TrkB Fc所阻断，考虑BDNF主要通过与TrkB受体结合从而发挥镇痛作用。以往研究大多针对内源性BDNF在疼痛发生发展过程中的作用，本实验通过鞘内注射外源性的BDNF，不仅验证了BDNF参与疼痛信号的调节，而且提出了BDNF作为镇痛药物的可能性。
有研究显示在糖尿病大鼠的DRG中BDNF mRNA水平增加[6]，糖尿病状态下内源性BDNF表达增多，可能在疼痛信号调节过程中发挥相应作用。另外BDNF的生物学功能也可能由于TrkB受体表达及功能改变而受到影响。外源性BDNF可能对DRG组织BDNF及TrkB受体的表达产生调节作用，但本实验结果显示鞘内给予BDNF和TrkB Fc对DPN大鼠BDNF和TrkB的表达无影响，可能与药物剂量较小或给药时程过短有关。
综上所述，外源性BDNF通过降低DRG神经元的过度兴奋缓解DPN大鼠的疼痛症状，BDNF可能是潜在的治疗糖尿病性神经病理性疼痛的新型药物，为治疗糖尿病神经病变提供了新思路。
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