2. 济宁医学院法医学与医学检验学院, 济宁 272067;
3. 济宁医学院司法鉴定中心, 济宁 272013
2. Institute of Forensic Medicine and Laboratory Medicine, Jining Medical University, Jining 272067, China;
3. Forensic Science Center of Jining Medical University, Jining 272013, China
短串联重复序列(short tandem repeats,STR)是由2~6个核苷酸为单位重复串联形成的长度小于400 bp的基因片段,不同个体重复次数的差异形成了STR基因座的高度遗传多态性[1-2]。同时,因其分布广泛、等位基因片段短、扩增及分型方法简单易行等优点已成为目前国际法医学界最常用的遗传标记[1]。
法医学鉴定工作中经常遇到一类特殊案件:活检或手术切除的肿瘤组织成为唯一的参照样本。然而突变是肿瘤的重要分子标志,STR基因座突变使肿瘤组织的基因型不能很好地代表该肿瘤来源个体的基因型,也使肿瘤组织参与的案件成为法医学鉴定的难点。
甲状腺癌是最常见的内分泌系统恶性肿瘤,发病率居全身恶性肿瘤第五位,已成为增长速度最快的恶性肿瘤[3]。甲状腺乳头状癌(papillary thyroid cancer,PTC)是甲状腺癌最常见的病理亚型,约占60%~70%[4-6]。本文选区鲁西南这一PTC高发地区,应用显微切割技术分析PTC肿瘤组织STR基因座的突变类型及规律,认识PTC肿瘤组织STR基因座突变的客观存在,从而筛选出较为稳定的STR基因座,以便于PTC肿瘤组织这类特殊检材在法医学鉴定工作中的应用。
1 资料与方法 1.1 一般资料收集济宁医学院附属医院2011年1月至8月期间经术后病理确诊PTC且未经放化疗治疗的41例患者的甲状腺肿瘤组织。组织取材后置于-80℃冰箱冷冻保存。
1.2 仪器与试剂CM1850型冰冻切片机(Leica公司,德国);激光捕获显微切割系统(MMI公司, 瑞士);9700型PCR扩增仪(AB公司,美国);ABI3500型遗传分析仪(AB公司,美国);GeneMapperID-X分析软件(AB公司,美国);华夏白金PCR试剂盒(AB公司,美国)和Goldeneye DNA身份鉴定系统20A试剂盒(基点认知公司,中国),除性别基因座外两试剂盒共有19个相同的STR基因座:D19S433、D5S818、D21S11、D18S51、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、vWA、D8S1179、TPOX、TH01、D2S1338、FGA、Penta E、Penta D、D6S1043、D12S391。
1.3 实验方法 1.3.1 组织切片染色和激光捕获显微切割将组织标本8μm连续切冰冻切片4~6片贴附于MMI显微切割专用覆膜载玻片(MMI公司, 瑞士)上;将载玻片置于丙酮中固定1min后浸入苏木素染液染核2min,1%盐酸酒精分化、1%氨水反蓝;伊红染色40s,每一步间用蒸馏水冲洗30s;经梯度酒精脱水;入二甲苯中透明;通风橱晾干后立即进行显微切割。在MMI激光捕获显微切割系统视野中分别切割收集肿瘤细胞及癌旁正常间质细胞约5×104个。
1.3.2 STR扩增及分型检测Chelex-100法提取PTC肿瘤细胞和癌旁正常间质细胞的DNA。采用重复实验和两种试剂盒相互验证的方法扩增上述所提取的DNA,扩增体系和反应条件参照相关试剂盒说明书进行。应用ABI 3500型自动遗传分析仪对扩增产物进行电泳,然后使用GeneMapper ID-X分析软件进行STR分型。
1.4 统计学方法应用Hardy-Weinberg平衡软件对23个STR基因座进行吻合度检验。采用计数法统计各种突变类型的突变率,应用SPSS17.0统计软件进行统计学分析,检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 激光捕获显微切割PTC细胞A、B分别是PTC肿瘤细胞经显微切割前后的对比图片(图 1)。
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图 1 激光捕获显微切割PTC患者组织样本(×200) |
经验证,STR分型结果一致且正确。两试剂盒中7个共有基因座的分型结果:D3S1358(15、16)、vWA(17、18)、D16S539(13)、CSF1PO(10)、TPOX(9、11)、D13S317(11、12)、D7S820(11、12)。
2.3 基因平衡(Hardy-Weinberg)吻合度验证结果41例患者各基因座基因型的观察值与期望值无显著差异(P>0.05),符合Mendel遗传规律。见表 1。
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表 1 PTC患者23个STR基因座Hardy-Weinberg吻合度测验分析表 |
肿瘤细胞与癌旁正常间质细胞相比,出现了4种STR突变类型:Aadd、Anew、pLOH、LOH。见图 2。
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图 2 4种STR突变类型 注:Aadd,增加等位基因;Anew,新等位基因;pLOH,部分杂合性丢失;LOH,完全杂合性丢失;N:正常细胞;T:肿瘤细胞 |
4种突变类型中pLOH的检出率最高。见表 2。
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表 2 4种突变类型的突变检出率 |
Penta E基因座MSI检出率最高,CSF1PO、Penta E基因座STRGA检出率最高,vWA、D16S539、D8S1179、D21S11、D5S818、D13S317、D10S1248和D1S1656基因座均未发现突变。见表 3。
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表 3 STR突变类型在基因座上的分布 |
为保证突变结果的客观存在本研究对PTC肿瘤组织的来源进行了严格筛选,将已确诊为PTC且未经放化疗治疗作为纳入指标。由于一些研究发现即使在癌前病变的组织中也可检测到LOH的发生[7-8],因此我们选取癌旁正常间质细胞作为对照组,确保了对照组基因无突变;并且采用重复实验和两种试剂盒相互佐证、补充的方法,确保STR分型结果准确性的同时,更全面获得了PTC肿瘤细胞STR基因座的突变情况。
肿瘤组织是一个复杂的整体,除肿瘤细胞外还含有一些研究非必需的甚至会对研究结果造成影响的细胞,如:间质细胞、炎细胞及淋巴细胞[9]。因此,由整块肿瘤组织得出的实验结果重复性、可靠性差,不能真实的反应肿瘤细胞自身的基因状态[9-10]。本研究应用显微切割技术快速、准确的分离出PTC组织中的肿瘤细胞和癌旁正常间质细胞,得到了均一的肿瘤研究个体,排除非肿瘤细胞对基因研究的干扰,确保了实验结果的可靠性。
本研究发现了Aadd、Anew、pLOH及LOH 4种STR突变类型,与先前文献报道一致[11-15]。本文结果显示,pLOH的检出率最高,然而pLOH的发生不改变STR基因座的分型,因此不影响法医学组织身源鉴定结果的正确性。Aadd和Anew通称为微卫星不稳定(microsatellite instability, MSI),是由错配修复基因缺陷所导致。LOH是由引物结合区突变或模板链卷曲所导致。MSI与LOH均可引起基因型的改变(STRGA),这种改变会使组织身源鉴定结果面临误判的风险,因此应用肿瘤标本作为DNA分型来源时应谨慎[16-18]。Ceccardi等[15]研究的68例原发肿瘤样本中15个STR基因座均存在STRGA,其中vWA、FGA和D18S51的检出率最高,分别为13 (19.1%)、13 (19.1%)、12 (17.6%)。本文结果中TRGA在CSF1PO、Penta E基因座检出率最高,MSI在Penta E基因座的发生率最高。在肿瘤细胞中MSI的总发生率为19.52%,高于Lawes等[19]报道的所有类型甲状腺癌的MSI发生率(8~10%),这可能与我们选取PTC高发地区,以及激光显微切割“提纯”肿瘤细胞技术的应用有关。
本实验所研究的21个基因座中有8个未发现STR突变,分别为vWA、D16S539、D8S1179、D21S11、D5S818、D13S317、D10S1248和D1S1656,其中6个基因座包含在美国联邦调查局所规定的13个必需基因座中,因此市面上多数STR复合扩增试剂盒均适用于PTC肿瘤组织身源鉴定。Zhang等[16]在所研究的75例肺癌组织中,发现21个基因座中仅D2S441和Penta E基因座未发生突变。Vauhkonen等[12]研究发现41例胃肠道恶性肿瘤组织样本中,15个基因座仅有TH01一个基因座未发生STRGA。因此,相比于肺癌及胃肠道恶性肿瘤,PTC肿瘤组织的稳定性更高,肿瘤组织身源鉴定的应用价值更大。
综上,本文阐述了PTC肿瘤细胞中STR基因座的突变类型和突变规律,同时筛选出了8个未发生突变的STR基因座,为指导PTC肿瘤组织在法医鉴定工作中的应用提供理论依据。
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