肠道病毒71型(Enterovirus 71)简称EV71，属于小RNA病毒科，肠道病毒属，是手足口病最常见的病原体之一，具有明显的噬神经性[1]。EV71感染可引起多种疾病，轻者如疱疹性咽峡炎、手足口病，重者如脑膜脑炎、急性弛缓性麻痹、急性肺水肿、脑干脑炎甚至导致休克、死亡[2-4]。自1974年首次报道以来，EV71已在世界多个国家和地区引起暴发流行，其中重症感染的致残率和死亡率很高，给家庭和社会带来了沉重的社会负担[5-8]。EV71感染引起的临床表现迥异、预后截然不同，主要与病毒毒力和宿主易感性等有关。有研究结果显示，IFN-γ基因的第一内含子区+874T/A单核苷酸多态性可影响IFN-γ的表达量，血清中高水平的IFN-γ可激活巨噬细胞和抗病毒作用，促进树突状细胞(DC)中主要组织相容性复合物(MHC)的表现和抗原呈递，促进免疫调节[9-10]。
白细胞介素18(Interleukin-18，IL-18)简称IL-18，又称为IFN-γ诱导因子，是一种18.3kDa的促炎细胞因子，作为IL-1细胞因子家族的成员，在先天性免疫反应中发挥着至关重要的作用[11]。除此之外，IL-18的成熟受活化的NLRP3炎性体控制，可保护机体免受致命的EV71感染。人类基因组中，IL-18基因位于11号染色体q22.2-22.3区域，其-607位点位于IL-18基因的5'-非编码区[12]。据报道，多种疾病与IL-18启动子区域-607C/A单核苷酸多态性相关，如哮喘，类风湿性关节炎(RA)，克罗恩病，多发性硬化症(MS)，复发性自发性流产(RSM)和1型糖尿病(T1DM)[12-17]。本研究旨在探讨中国儿童IL-18-607C/A基因多态性与EV71感染脑炎严重程度的关系。
1 资料和方法 1.1 一般资料收集2014年6月至2016年4月期间，青岛大学附属医院和青岛市妇女儿童医院收治的EV71检测阳性患儿185例(99名男性；6.20±3.69岁)为EV71组，同时期健康查体患儿214例为对照组，所有观察对象均符合以下标准：1)无任何遗传倾向性、代谢相关性疾病；2)取样时未确诊神经系统、心血管系统、肿瘤及其他严重健康问题。对感染组(入院后第二天)和对照组患儿(查体当日清晨)采集粪便样本提取RNA，通过逆转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)检测EV71核酸。根据中华人民共和国卫生部办公厅发布的手足口病诊疗指南(2010版)的标准，根据是否患有脑炎EV71感染患儿分脑炎组(93例；4.32±2.33岁)和非脑炎组，而EV71脑炎组包含严重的EV71脑炎病例(49例；3.21±3.48岁)和轻度EV71脑炎病例(44例；5.50±3.09岁)。脑炎组符合以下标准：1)出现神经系统受累表现。如精神反应差或者一般、嗜睡甚至昏迷、易惊或惊厥发作、谵妄；阵发性头痛、喷射状呕吐；肢体抖动、眼球震颤(水平或垂直)、共济失调；肌阵挛、无力或急性弛缓性麻痹。2)查体浅反射减弱或消失，脑膜刺激征阳性。3)脑脊液检测(白细胞计数＞5/mm3)、脑电图(EEG)、颅脑核磁共振(MRI)等辅助检查出现异常信号。其中，重症脑炎者需符合以下标准：1)频繁抽搐、长时间昏迷、脑疝、颈项强直、呼吸困难、紫绀、血性泡沫痰、肺部听诊啰音等；2)呼吸、消化、循环系统功能不全表现；3)颅脑MRI见局灶性或弥漫性脑实质改变等，EEG出现棘慢波、尖波等异常信号。本研究中的所有样本均通过临床问诊、体格检查、血常规、生化全套、MRI、脑脊液分析等辅助检查进行记录。该研究经青岛大学附属医院伦理委员会讨论通过，均征得患儿监护人知情同意并签署知情同意书后采集样本。在本研究过程中不存在死亡和失访的患儿。
1.2 方法 1.2.1 标本采集感染组患儿入院后第2天采集全样本儿童急性期(病程3d以内)静脉外周抗凝血4ml，对照组患儿于查体当日清晨采集外周抗凝血4ml，于-20℃冰箱内保存，留取粪便标本2ml于无菌容器中，-80℃冰箱内保存，同时记录年龄、性别等基础信息。
1.2.2 标本基因组DNA提取根据天根(TIANGEN)公司全血DNA提取试剂盒小体积(300μl)全血操作流程提取全部样本EDTA抗凝外周血中的基因组DNA，编码后置于-20℃冰箱内保存备用。
1.2.3 IL-18-607位点基因多态性检测采用改良的多重高温连接酶技术(iMLDR)检测IL-18-607C/A位点的基因多态性。IL-18-607C/A位点基因扩增引物为TAM-TTTGGTATCCCTCTCC-MGB, TET-TTTGGTAGCCCTCTV-MGB。多重PCR反应：每个PCR反应样本中包括iMDLRTM多重SNP分型试剂盒中多重PCR引物混合物1μl，2×PCR Master mix 5μl与1μl样本DNA，3μl ddH2O混合，置于PCR仪器中进行扩增。PCR扩增条件：95℃预变性2min、94℃变性20s、随后60℃退火30s、72℃延伸90s，重复35个循环，之后72℃延伸2min，保存在4℃下待用。PCR反应完成后加入试剂盒中的ExoI/SAP酶1μl，置于37℃温水浴1h，75℃灭火15min纯化产物。将试剂盒中的10×连接缓冲液2μl、高温连接酶0.2μl、连接引物混合液1μl与纯化后多重PCR产物3μl以及ddH2O 3.8μl混匀，置于94℃1min，56℃4min，重复35个循环，保存于4℃下备用。取0.5μl稀释后的连接产物，与0.5μl Liz500Size Standard荧光内标，9μl Hi-Di混匀，95℃变性5min后上ABI3130XL测序仪。利用ABI3130XL测序仪，收集原始数据并利用GeneMapper 4.0进行分析(由上海天昊生物科技公司完成)。
1.3 统计学方法根据Hardy-Weinberg平衡定律，分别对检测IL-18-607位点基因型分布及等位基因频率进行卡方检验，比较各不同分组间理论频数和实际频数是否存在显著差异。采用SPSS 21.0软件进行统计学分析，P＜0.05时，差异有统计学意义。非脑炎、脑炎组，轻、重脑炎组比较时，为了避免多次两两比较时易发生的Ⅰ类错误，应用Bonferroni校正修正每次比较的检验水准。
2 结果 2.1 IL-18基因型和等位基因的分布 2.1.1 IL-18-607C/A的不同基因型和等位基因的分布比较结果显示：EV71感染组和对照组间IL-18-607CC、CA、AA基因型频率存在显著差异(P＜0.05)；IL-18-607A等位基因频率明显高于对照组(P=0.01)。见表 1。
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表 1 EV71感染和对照组中IL-18-607C/A位点的基因型和等位基因分布(n/%) |
IL-18-607位点的基因型和等位基因频率在EV71脑炎组与非脑炎组中无明显差异。见表 2。
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表 2 EV71脑炎组和非脑炎组中IL-18-607C/A位点的基因型和等位基因的分布(n/%) |
轻症、重症脑炎组比较，基因型存在显著差异，但等位基因频率差异无显著意义。见表 3。
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表 3 两组中IL-18-607C/A位点的基因型和等位基因的分布(n/%) |
分析不同基因型的EV71感染病例的特征，CRP、白细胞计数、发热持续时间、血糖水平存在显著差异。而性别、年龄、ALT、AST、CK-MB没有明显差异。其他临床表现如呕吐、惊厥发作、精神改变、最高温、脑MRI和脑电图等分布也无明显差异。见表 4。
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表 4 EV71感染患儿不同基因型分组的临床特征 |
EV71具有明显的噬神经性，在儿童神经系统感染性疾病的流行中发挥着重要的病因学作用。EV71脑炎会导致长期的神经系统后遗症，降低认知功能，导致高死亡率[3, 18]。已有研究表明，MDA5、IL-10、IL-17F和CCL2-2510等基因多态性，在EV71的感染发生发展中起关键作用[15, 19-23]。当前动物实验表明，多效性IL-18作为NLRP3依赖的效应蛋白，是小鼠EV71感染的保护因子之一[24]。当发生致死EV71攻击时，NLRP3炎性体被EV713D蛋白激活，并形成EV71-3D-NLRP3-ASC环状结构。控制IL-18的成熟和分泌。有研究表明，重组IL-18显著抑制了IL-18缺陷小鼠中的EV71感染[25]。
正如Tavares[26]报道的那样，IL-18基因启动子区-607位点由C变为A可能导致IL-18基因表达的下调，最终导致IL-18的产生减少。IL-18基因缺陷小鼠更容易感染EV71并引起严重的EV71相关脑炎。本文结果显示，对照组与EV71感染组中A等位基因和AA基因型频率明显高于C等位基因和CC基因型，这项结果提示IL-18-607A SNP与EV71感染的易感性之间是相互关联的，即携带有IL-18-607AA基因型儿童更容易感染EV71病毒。与此同时，我们发现，脑炎和非脑炎患儿中IL-18-607位点的等位基因和基因型差异不大，而重症EV71脑炎和轻症EV71脑炎在IL-18-607基因型分布上存在显著差异。该变异可能引起严重EV71脑炎患者的TH1介导的免疫反应受损，并刺激NK细胞发挥细胞溶解作用，以至于免疫系统无法及时清除侵入性EV71病毒，导致重症EV71脑炎的发展[23-24]。此外，IL-18作为IFN-γ的诱导因子，通过NF-κB影响其表达量，从而导致重症EV71感染脑炎的发生[27-30]。我们有理由推测：IL-18-607位点A等位基因与EV71脑炎的严重程度可能相关，但与易感性关系不明显。
此外，EV71感染患儿中，IL-18-607AA基因型患者的C-反应蛋白，白细胞计数，血糖浓度和发热持续时间较CC和CA基因型明显升高，这些指标对评估EV71感染严重程度尤为重要[21]。血糖浓度常与急性重症感染相关，白细胞计数升高与机体炎症爆发、免疫机制紊乱关系密切[21]，提示我们IL-18-607A等位基因有可能参与加重儿童EV71感染时的炎症反应过程。与此同时，性别、年龄、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、CK-MB在各基因型中没有明显差异。脑电图，MRI、呕吐，惊厥发作，精神变化和体温39℃以上均未发现显著差异。我们暂时未发现IL-18不同基因型中其他辅助检查的差异，后期还需要扩大样本量，大数据统计分析IL-18-607位点SNP是否与其他器官功能异常相关。因此，我们推测IL-18-607A可能涉及严重EV71感染的炎症过程，但其机制尚不清楚。
综上所述，携带有IL-18-607AA基因型的患儿对EV71感染具有易感性，更容易引发重症中枢神经系统感染。
本项研究还存在不足之处。首先，样本量不够大，这可能导致该样本的特征反映整体特征的一部分。其次，未检测和分析血清中IL-18浓度和其他免疫相关分子的浓度。此外，应该深入研究IL-18-607A SNP影响EV71感染进程的相关机制。
致谢本文得到了国家自然科学基金(资助编号31640047)的支持，并由中国上海天昊生物科技公司提供技术支持，感谢患儿家属提供血液样本，并在我们的研究中提供临床数据。
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