骨质疏松症(OP)是绝经后女性常见的骨代谢性疾病，我国50岁以上女性骨质疏松症患病率为20.7%^[1]。研究表明绝经后骨质疏松症与雌激素水平降低密切相关^[2]，临床上雌激素替代疗法治疗绝经后骨质疏松有明确疗效，但长期使用可能会导致中风、静脉栓塞等风险增加，且存在诱发肿瘤的风险^[3]。左归丸是补肾滋阴经典方剂，治疗骨质疏松症取得良好临床疗效，但其作用机制尚不明确^[4]。T细胞是重要的免疫细胞，T细胞亚群相关细胞因子表达与雌激素水平存在显著相关性^[5]。我们前期研究发现左归丸能调节Th1/Th2亚群平衡改善雌激素缺乏导致的骨密度下降^[6]，但Th17/Treg亚群在本病中的作用尚缺乏临床研究。本研究通过观察女性绝经前后雌激素水平、骨密度和静脉血Th17/Treg亚群变化，从免疫学角度探讨女性绝经后骨量丢失的发病机制，阐释左归丸调节Th17/Treg亚群平衡治疗绝经后骨质疏松症的机制，为指导临床用药提供依据。

选择2016年1月至2017年11月在山东中医药大学附属医院查体妇女45例，其中健康未绝经妇女15例为未绝经组，自然绝经妇女30例。未绝经组妇女，年龄25~35岁，平均(31.2±2.6)岁，平素身体健康，月经规律，未妊娠，纳入未绝经组。自然绝经妇女，年龄在55~65岁，平均(60.3±3.8)岁，绝经时间均在2年以上，随机分为绝经组与左归丸组各15例，2组一般资料比较差异无明显统计学意义(P＞0.05)。所有研究对象均被详细询问病史，没有影响骨代谢的其它疾病，未用雌激素替代治疗，并签署知情同意书。本研究已经通过山东中医药大学附属医院伦理委员会的批准。

雌二醇ELISA试剂盒购于德国罗氏公司；人外周血淋巴细胞分离液购于TBD sciences公司；RT-PCR试剂(M-MLV、dNTP、RNA酶抑制剂等)购于生工生物工程(上海)有限公司；PMA、Ionomycin购于Sigma公司；氯仿、无水乙醇、异丙醇购于天津市广成化学试剂有限公司；IL-17A、IL-10、β-actin引物购于上海博尚生物技术有限公司，引物序列见表 1。

表 1

表 1 PCR引物序列及长度 基因 序列 产物长度 IL-17A Forward:TCCACCGCAATGAAGACC Reverse:CACGAAGCAGTTTGGGAC 420bp IL-10 Forward:AGGGCACCCAGTCTGAGAACA Reverse:CGGCCTTGCTCTTGTTTTCAC 351bp β-actin Forward:GTGGGGCGCCCCAGGCACC Reverse:CACCTTAATGTCACGCACCA 500bp

表 1 PCR引物序列及长度

左归丸组绝经妇女予左归丸(河南省宛西制药股份有限公司，国药准字Z41020696)9g/次，每日2次，口服。2周为1疗程，连服2个疗程后，空腹抽取静脉血。

取研究对象空腹静脉血4ml，其中2.5ml采用EDTA抗凝，Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，用于流式细胞术、Westen blot及RT-PCR检测, 1.5ml离心后取血清用于电化学发光法检测血清雌二醇(E₂)水平，

收集外周血单个核细胞，1×PBS洗2遍，去上清，调整细胞浓度为1×10⁶个/ml, 细胞重悬于100μl 1×PBS，将抗体按说明书加到细胞悬液中，4℃避光孵育30min，1×穿膜Buffer洗1遍，1×PBS洗1遍，去上清，200ml 1×PBS重悬细胞，转管上机检测。

RIPA裂解液裂解外周血单个核细胞30min，离心12000r/min，取上清蛋白，混合摇匀，沸水煮3min，取出，电泳分离转膜；25ml TBS洗膜5min，室温下摇动；置膜在25ml封闭缓冲液中1h, 室温下摇动，15ml TBS/T洗3次(5min/T)，加入1 :250稀释的RORγt、Foxp3一抗，室温下孵育1h，缓慢摇动，15ml TBS/T洗3次(5min/T)；加入1 :1000辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗，室温孵育1h，摇动，15ml TBS/T洗3次(5min/T)，15ml TBS洗1次；化学发光法测蛋白表达。

外周血单个核细胞mRNA提取、RT反应及PCR反应参考文献^[5]报道。采用Alpha凝胶成像系统分析图像。

双能X线骨密度仪测定研究对象腰椎2-4(L_2-4)前后位BMD。

应用SPSS11.5软件进行统计分析。计量资料以x±s表示，采用One Way-ANOVA方差分析，两组间比较采用Turkey法检验，数据间相关性用Pearson相关性分析。各组数据以P＜0.05表示差异有统计学意义。

与未绝经组比较，绝经组血清E₂和BMD表达明显降低(P＜0.05)；与绝经组比较，左归丸组E₂表达无明显差异(P＞0.05)，BMD水平明显升高(P＜0.05)，提示左归丸能提高绝经妇女的骨密度，且对绝经妇女E₂表达无影响，无明显雌激素样作用，见表 2。

表 2

表 2 各组E2及BMD水平比较(x±s) 组别 n E2/ng·L-1 BMD/g·cm-2 未绝经组 15 91.11±10.01 1.28±0.07 绝经组 15 33.73±7.12* 0.87±0.14* 左归丸组 15 37.09±6.23 1.10±0.16△ F值 245.982 38.809 P 0.000 0.000 注：与未绝经组相比较，*P＜0.05；与绝经组比较，△P＜0.05

表 2 各组E2及BMD水平比较(x±s)

与未绝经组相比，绝经组Th17亚群比例显著升高，Treg亚群比例降低(P＜0.05)，T细胞向Th17亚群偏移。与绝经组相比，左归丸组Th17亚群比例显著降低，Treg亚群比例升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)，见表 3。

表 3

表 3 各组Th17、Treg亚群比例比较(%, x±s) 组别 n Th17 Treg 未绝经组 15 3.65±1.64 3.74±0.71 绝经组 15 5.49±1.04* 1.92±0.68* 左归丸组 15 4.23±0.94△ 3.17±0.83△ F值 8.567 23.470 P 0.001 0.000 注：与未绝经组相比较，*P＜0.05；与绝经组比较，△P＜0.05

表 3 各组Th17、Treg亚群比例比较(%, x±s)

相关性分析显示，E₂表达与骨密度呈正相关(P＜0.05)；骨密度与Th17亚群比例呈负相关(P＜0.05)，与Treg亚群比例呈正相关(P＜0.05)；E₂表达与Th17亚群比例呈负相关(P＜0.05)，与Treg亚群比例呈正相关(P＜0.05)，见表 4。

表 4

表 4 E2、BMD与T细胞亚群比例的相关性分析 指标 E2与BMD E2与Th17 E2与Treg BMD与Th17 BMD与Treg r值 0.685 -0.451 0.559 -0.474 0.685 P 0.000 0.002 0.000 0.001 0.000

表 4 E2、BMD与T细胞亚群比例的相关性分析

与未绝经组比较，绝经组Th17亚群特异性核转录因子RORγt蛋白表达明显升高(P＜0.05)，Treg亚群特异性核转录因子Foxp3蛋白表达明显降低(P＜0.05)；与绝经组比较，左归丸组RORγt蛋白表达明显降低(P＜0.05)，Foxp3蛋白表达明显升高(P＜0.05)，见表 5。

表 5

表 5 各组间RORγt、Foxp3蛋白表达比较(x±s) 组别 n RORγt Foxp3 未绝经组 15 38.64±9.33 22.07±9.24 绝经组 15 50.61±9.11* 11.86±5.39* 左归丸组 15 42.10±8.89△ 19.96±4.56△ F值 6.852 9.676 P 0.003 0.000 注：与未绝经组相比较，*P＜0.05；与绝经组比较，△P＜0.05

表 5 各组间RORγt、Foxp3蛋白表达比较(x±s)

与未绝经组比较，绝经组Th17亚群特征性细胞因子IL-17A mRNA表达明显升高，Treg亚群特征性细胞因子IL-10mRNA表达明显降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)；与绝经组相比，左归丸组IL-17A mRNA水平明显降低，IL-10 mRNA水平明显升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表 6。

表 6

表 6 各组间IL-17AmRNA、IL-10mRNA相对灰度值比较(x±s) 组别 n IL-17AmRNA IL-10mRNA 未绝经组 15 20.25±9.25 15.87±7.64 绝经组 15 31.99±9.01* 8.27±5.25* 左归丸组 15 23.90±7.40△ 13.46±4.35△ F值 7.341 6.487 P 0.002 0.004 注：与未绝经组比较，*P＜0.05；与绝经组比较，△P＜0.05

表 6 各组间IL-17AmRNA、IL-10mRNA相对灰度值比较(x±s)

在骨代谢过程中，成骨细胞(OB)参与骨的形成，破骨细胞(OC)参与骨的吸收，这一动态平衡被打破就会导致骨代谢疾病如骨质疏松症的发生。研究表明骨代谢受内分泌系统、免疫系统的调节，三者共享细胞因子、转录因子、受体及信号分子等多种调控分子^[7-8]。雌激素是人体重要的内分泌激素，绝经后女性雌激素水平明显降低，T细胞是重要的免疫调节细胞，雌激素、T细胞、骨代谢三者之间的关系成为本领域研究的热点。

初始T细胞接受抗原刺激而活化，分化为不同的T细胞亚群分泌特征性细胞因子主导不同的免疫反应。Th17、Treg是最新发现的T细胞亚群，产生于同一种前体细胞CD4⁺ T细胞，在维持破骨细胞-成骨细胞平衡中发挥重要作用。Th17是初始T细胞在IL-6和IL-23的刺激下分化而成的辅助性T细胞，主要分泌IL-17、IL-22等促炎症因子，RORγt是其重要的转录因子，在自身免疫中起重要的作用；Treg是调节性T细胞，在肿瘤、移植耐受甚至是病原体感染等免疫反应调节中起重要作用。Th17和Treg通过分泌OC分化关键调控因子对骨代谢发挥正向和负向调控作用。研究表明，Th17亚群分泌的IL-17A能触发局部炎症反应并产生TNF-α等炎性细胞因子，促进OC形成，导致骨质流失^[9]。相关临床研究显示，Th17细胞分泌的IL-17与绝经后骨质疏松的发生关系密切^[10]。Treg亚群分泌的TGF-β抑制OC生成，促进OC凋亡^[11]。Th17和Treg共享趋化因子受体，在一定的条件下可互相转化^[12]。Th17/Treg亚群的极化状态会导致骨代谢异常，而体内雌激素水平会影响T细胞亚群的极化状态。雌激素是人体重要的性激素，参与人体多种器官的发育和免疫调节，雌激素缺乏对骨代谢有重要影响。Cenci等^[13]研究认为T细胞上具有雌激素受体，雌激素缺乏会引起T细胞亚群极化，从而影响骨代谢。本文结果显示，女性绝经后血清E₂水平与腰椎BMD均明显降低、血清E₂表达与腰椎BMD呈正相关；Th17亚群比例升高、Treg亚群比例降低；血清E₂表达、腰椎BMD与Th17亚群比例呈负相关，与Treg亚群比例呈正相关，并发现女性绝经后RORγt蛋白表达、IL-17AmRNA表达升高，Foxp3蛋白表达、IL-10mRNA表达降低，提示Th17/Treg亚群偏移参与了雌激素缺乏导致的骨丢失。

临床研究证明雌激素治疗女性绝经后骨质疏松疗效明确，但会增加女性患雌激素依赖性疾病如子宫内膜癌、乳腺癌等的风险^[14-15]。中药治疗骨质疏松症能明显改善症状，且副作用小^[1]。中医学中骨质疏松症属“骨痿”“骨痹”的范畴。《素问·痿论》指出：“肾主身之骨髓”。研究证实补肾中药能通过激活Hedgehog信号传导通路中骨组织的SHH和GLi1，抑制骨吸收，促进骨形成, 提高去卵巢大鼠的骨密度^[16]。左归丸是补肾经典方剂，实验表明左归丸能改善骨质疏松症模型动物骨代谢相关指标，对促进骨形成，抑制骨吸收有积极作用^[17]。本文结果显示绝经后妇女服用左归丸后，骨密度明显增高且血清E₂水平无明显变化，提示左归丸治疗骨质疏松有效且无明显雌激素样作用；RORγt蛋白表达明显降低和Foxp3蛋白表达明显升高，表明左归丸能下调Th17亚群特异性核转录因子蛋白表达，上调Treg亚群特异性核转录因子蛋白表达，诱导Th17/Treg亚群向Treg偏移，抑制溶骨性细胞因子的产生，从而减少骨丢失。

本文结果显示，绝经后女性雌激素水平降低促进骨吸收细胞因子的表达，诱导Th17/Treg亚群向Th17偏移，左归丸能逆转Th17/Treg亚群失衡状态，减少骨丢失，增加骨密度，从而减轻绝经后妇女骨质疏松的症状。本文结果进一步揭示了Th17/Treg亚群偏移对绝经后骨质增生症的影响，阐释了左归丸逆转Th17/Treg亚群偏移减少骨丢失的免疫学机制，为指导绝经后骨质疏松症的临床中药治疗提供了新的依据。