2. 济宁医学院附属医院, 济宁 272029
2. Affiliated Hospital of Jining Medical University, Jining 272029, China
胶质细胞瘤(Glioblastoma，GBM)是颅内最常见的恶性肿瘤，其以侵袭性强、增殖速度快和术后易复发为显著特点[1]。即使经过手术、放疗和化疗等综合治疗后，患者的平均生存时间也只有18个月左右[2]。而且，治疗GBM的一线化疗药物替莫唑胺(Temozolomide，TMZ)已表现出明显的耐药性。目前，具有抗肿瘤[3]、抗炎[4]和神经保护[5]等作用的柯里拉京(Corilagin)关注度与探索价值越来越高。本实验以不同浓度的Corilagin干预U373 MG细胞，并检测药物干预后不同时间段的细胞增殖活性及迁移能力的变化，观察Corilagin对胶质瘤细胞的影响，并为Corilagin的临床运用提供一个新的依据。
1 材料与方法 1.1 材料U373MG胶质瘤细胞系(中国典型培养物保藏中心)；RPMI-1640培养基(美国Gibco公司)；青-链霉素双抗(美国HyClone公司); 胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(美国HyClone公司)；胰蛋白酶(美国Gibco公司); PBS磷酸缓冲液(普诺赛生命科技有限公司)；Corilagin(美国Sigma公司)；Cell CountingKit-8(CCK-8)试剂盒(碧云天生物技术研究所); MK3型酶标仪(美国赛默飞世尔科技公司)。
1.2 U373MG细胞培养取U373MG细胞接种在含有完全培养基(RPMI-1640+1%青-链霉素双抗+10%FBS)的25cm2的透气细胞培养瓶中，置于恒温细胞培养箱(37℃，5%CO2饱和湿度)中进行培养。每日用显微镜观察细胞的生长状况，每2日更换一次细胞培养液，当肿瘤细胞铺满培养瓶底约80%(48~72h)时即可传代，如此循环培养，直至所需细胞数。
1.3 CCK-8试剂盒检测细胞增殖活性选取培养的U373MG细胞接种于96孔板上，每孔约5000个(100μl)细胞，完全培养基培养24h后弃掉培养基，重新加入RPMI-1640 100μl，24h后再弃掉96孔板中的RPMI-1640培养基，配制的含不同浓度的Corilagin培养液(完全培养基+Corilagin)，Corilagin浓度分别为25、50、100、200μmol·L-1(以0μmol·L-1为对照组，用RPMI-1640代替)，按实验设计每孔加100μl，每组均设3个复孔，分别干预24、48、72h，并分别加入100μl RPMI-1640+CCK-8混合液(RPMI-1640 :CCK-8=10 :1)，置于恒温培养箱中培养2h后，用酶标仪检测每个孔的吸光度值，每个检验重复3次，检测波长450nm，参照波长630nm。计算细胞存活率(%)=[(干预组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)]×100%。
1.4 细胞划痕实验选培养至传代的U373MG细胞接种于6孔板中，每孔约2×105个(2ml)细胞，正常培养24h后，用无菌枪头(10μl)均匀划痕，并用PBS冲洗掉细胞碎片，更换细胞培养液，实验组培养液含Corilagin浓度为200μmol·L-1，对照组为不加Corilagin的培养液，再继续培养24、48和72h，在显微镜下每24h观察1次，并测量细胞的迁移距离，拍照记录并计算细胞迁移度，迁移度(%)=(划痕时两侧距离-检测时两侧距离)/划痕时两侧距离×100%。
1.5 统计学方法采用SPSS 24.0软件进行分析，数据以均数±标准差的形式表示，采用t检验进行组间比较，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 U373MG细胞形态观察未经Corilagin干预的U373MG细胞，其状态良好，铺满孔底，紧密贴壁生长，并且细胞结构完整，胞体大致呈圆形、多角形、椭圆形等。而25、50、100、200μmol·L-1浓度Corilagin干预U373MG细胞后，随着药物浓度的升高或者干预时间的延长，U373MG细胞的形态逐渐发生变化，细胞有不同程度皱缩，细胞生长密度液逐渐降低，并可见大量散在的细胞碎片，细胞生长受到明显抑制。
2.2 Corilagin对U373MG细胞增殖活性的影响U373MG细胞经不同浓度Corilagin干预24、48、72h后，经CCK-8试剂盒检测发现，在干预时间相同的条件下，与对照组相比，U373MG细胞的存活率随着Corilagin浓度的增加而逐渐降低，差异具有统计学意义(P＜0.05);在药物浓度相同的条件下，与对照组相比，U373MG细胞的存活率随着Corilagin干预时间的延长逐渐降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。见图 1。
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图 1 Corilagin对U373MG细胞存活率的影响 |
与对照组相比，在含200μmol·L-1 Corilagin血清培养基中培养24、48和72h后U373MG细胞的迁移度均明显降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表 1、图 2。
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表 1 两组U373MG细胞不同时间点迁移能力的比较 |
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图 2 各组U373MG细胞迁移能力比较(×100) |
脑胶质瘤具有侵袭性强和复发率高的特点[6-7]，经过手术切除后行化疗等标准治疗后，胶质瘤患者的生存期依旧很低[8]，而且，治疗GBM的一线化疗药物TMZ已存在明显的耐药性[9]，因此，目前急切需要一种新的化疗药物来替换或提高TMZ的疗效。Corilagin又名柯子次鞣素，属天然植物多酚单宁酸类化合物，分子式是C27H22O18，分子量634.46，为白色针晶状粉末，是蜜柑草总甙抗肿瘤作用的主要活性成分[10-11]。Corilagin具有多种药理作用，主要涉及抗肿瘤[3]、抗炎[4]、神经保护[5]等作用，应用前景良好，已有大量研究人员对其作用机制进行了密切关注及探索。
本文应用Corilagin干预胶质瘤U373MG细胞，发现随着药物浓度的增加或者干预时间的延长，Corilagin促使胶质瘤U373MG细胞的增殖活性逐渐降低；U373MG细胞划痕实验的迁移度降低，说明Corilagin能够有效抑制U373MG细胞的生长。通常细胞增殖与细胞程序性凋亡是正常的生理过程，并维持在一个平衡状态[12]，如果能够打破细胞增殖与凋亡之间的平衡状态，那么就可对肿瘤的生长进行有效的干预[13]，因而，可通过干涉细胞增殖及程序性凋亡等途径对肿瘤进行治疗[14]。本文结果显示，U373MG细胞在不受药物干预的情况下培养不同时间后进行CCK-8检测，细胞生长不受抑制; U373MG细胞在Corilagin干预下生长遭到抑制，U373MG细胞增殖活性与培养时间呈负性依赖关系。在药物浓度相同的条件下，Corilagin对U373MG细胞的抑制作用随着药物干涉时间的延长逐渐增强，并且细胞裂解也越严重。在干预时间相同的条件下，随着药物浓度的增加，Corilagin对U373MG细胞的抑制作用，以及细胞的裂解程度越来越明显。通过划痕实验证实，U373MG细胞在含有200 μmol·L-1 Corilagin的培养基中培养24、48和72h后，U373MG细胞的迁移度均明显低于对照组，说明Corilagin对U373MG细胞的生长具有明显的抑制作用。
综上所述，Corilagin能有效抑制人脑胶质瘤U373MG细胞的增殖活性和迁移能力，为Corilagin能否应用于胶质瘤的临床化学治疗提供一个新的实验依据。
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