农业生产中，渗透胁迫是影响作物产量的一个重要环境因素，包括干旱胁迫和高盐胁迫。我国每年因干旱等自然灾害导致粮食减产达10%以上，而这个比例因温室效应加剧还在逐年增加[1]。因此，面对这些自然灾害，提高农业生产力，是我们亟待解决的科学问题。
DnaJ蛋白，是广泛存在于细胞内的一种分子伴侣，具有完成蛋白质折叠、解折叠、向特定细胞器运输和调节蛋白复合物解聚等功能[2]。据报道，DnaJ蛋白能参与细胞内多种生化过程和响应多种胁迫反应，进而增强植物的抗逆性[3]。大肠杆菌(Escherichia coli)是一种革兰氏阴性菌，是遗传学和生物化学研究常用的菌体。酵母作为一种真核生物，细胞对渗透压的反应是相对恒定的，比植物更易用于遗传研究。本研究中，我们首次从番茄叶片中分离克隆得到SlCDJ2基因，经过生物信息分析发现，SlCDJ2基因编码的蛋白属于DnaJ蛋白家族[4]。将SlCDJ2基因转入大肠杆菌和酵母中，与野生菌株相比，转基因大肠杆菌和酵母均提高了对渗透胁迫的抗性。报道如下。
1 材料与方法 1.1 材料实验菌株:大肠杆菌(Escherichia coli strain BL21)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae strain YPH500)，由山东农业大学作物生物学国家重点实验室提供。
1.2 方法 1.2.1 SlCDJ2基因的克隆及测序在NCBI GEN EBANK数据库中查得SlCDJ2基因的mRNA序列(GenBank序列号：AK323942)，设计特异引物(上游引物：ATGAGCAATTTGAGATCGAT；下游引物：CTATAGATTCTTATCGTCCTCCT)，以番茄叶片的cDNA为模板，进行PCR扩增，程序为95℃预变性5min；95℃ 50s，55℃退火50s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。随后对PCR产物进行测序验证。
1.2.2 SlCDJ2基因在大肠杆菌中的表达设计特异性引物，上游引物：GGATCCATGAGCAATTTGAGATCGAT，下划线是BamH Ⅰ；下游引物：GAGCTCCTATAGATTCTTATCGTCCTCCT，下划线是Sac Ⅰ。将SlCDJ2基因的编码序列采用PCR技术扩增出来，利用酶切位点BamH Ⅰ和Sac I，进行双酶切反应，将该基因编码序列连接到原核表达载体pET30a上。然后，将重组质粒转化E.coli BL21，获得阳性菌株，再将野生菌株和阳性菌株分别在20ml LB液体培养基中培养(37℃，200rpm/min)，当菌液OD600=0.6时，首先将野生菌液和转基因菌液各取1ml，置于4℃冰箱内备用，再向剩余菌液加入IPTG(Isopropylthio-β-d-galactoside)，使其终浓度为1mM，持续培养6h，每隔1h，取样1次，将所有样品，经10000rpm/min，离心1min，倒掉上清，菌体沉淀备用。最后，经SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)将诱导表达的蛋白分离开来[5]。
1.2.3 大肠杆菌在渗透胁迫下的生长分析为了分析含空载pET30a和含有pET30a-SlCDJ2重组质粒的大肠杆菌在正常和盐胁迫下的生长情况，首先配制IPTG终浓度为1mM，NaCl终浓度分别为200mM、400mM和800mM的LB液体培养基，各100ml。然后，取100μl OD600=0.8的菌液分别加入以上LB液体培养基中，37℃，200rpm/min，持续培养28h。同样，为了分析含空载pET30a和含有pET30a-SlCDJ2重组质粒的大肠杆菌在干旱胁迫下的生长情况，首先配制IPTG终浓度为1mM，甘露醇(Mannitol)终浓度分别为200mM、400mM和800mM的LB液体培养基，各100ml。然后，取100μl OD600=0.8的菌液分别加入以上LB液体培养基中，37℃，200rpm/min，震荡培养28h。最后，使用分光光度计检测不同时间点的菌体OD600值。以上实验均进行3次生物学重复。
1.2.4 酵母表达载体的构建首先设计特异性引物，上游引物：GAGCTCATGAGCAATTTGAGAT CGAT，下划线是Sac Ⅰ；下游引物：GGATCCCTATAGATTCTTATCGTCCTCCT，下划线是BamH Ⅰ。采用PCR技术扩增SlCDJ2基因的编码序列。再利用Sac I和BamH Ⅰ内切酶将PCR产物和酵母表达载体pYES2进行双酶切反应，最终将SlCDJ2基因的编码序列连接到酵母表达载体pYES2上，构建重组质粒。
1.2.5 酵母遗传转化将酵母空载pYES2和pYES2-SlCDJ2重组质粒转入酵母(Saccharomyces cerevisiae strain YPH500)中。利用醋酸锂酵母转化系统获得了阳性酵母菌株[6]。
1.2.6 酵母在渗透胁迫下的生长分析S.cerevisiae strain YPH500在YPD(yeast extract/peptone/dextrose)培养基中培养，而含有重组质粒的酵母菌株在YNBUra-(yeast nitrogen extract，(NH4)2SO4，glucose，His/trp/leu/lys和Ademine)培养基中培养。为了分析含空载pYES2和pYES2-SlCDJ2重组质粒的酵母菌在正常和渗透迫下的生长情况，首先，分别配制NaCl和Mannitol终浓度为200mM、400mM和800mM的YNBUra-固体培养基。然后，挑取阳性菌株到10ml YNBUra-液体培养基(含终浓度2%的棉子糖)中，28℃，200rpm/min，震荡培养72h后，吸取1ml培养物到25ml YNBUra-液体培养基(含终浓度2%的半乳糖，1% NP-40)中，22℃，200rpm/min，继续震荡培养48h，直至菌液OD600=1.0。吸取100μl的菌液连续稀释10倍，稀释3次，将稀释后的菌液吸取10μl点在不同浓度NaCl和Mannitol的培养基上，28℃条件下，培养5d，拍照记录。
1.3 统计学方法所有数据结果均以x±s表示，在SPSS 18.0统计分析软件中利用t检验进行组间比较，P < 0.05，为差异有统计学意义。
2 结果与分析 2.1 SlCDJ2基因的克隆根据NCBI GenBank数据库中的mRNA序列(GenBank序列号：AK323942)，设计特异引物，以番茄叶片总RNA反转录获得的cDNA为模板，进行PCR扩增，经过琼脂糖凝胶电泳分离到一条834 bp的DNA条带，与GenBank数据库中查得的大小一致(图 1)，测序结果显示序列完全正确。这些结果说明，成功地克隆得到了SlCDJ2基因。SlCDJ2基因全长为1159bp，开放阅读框为834bp，第66个核苷酸处为起始密码子ATG，第898个核苷酸处为终止密码子TAG，开放阅读框编码277个氨基酸，预测分子量为32.7kDa，等电点为9.30(http://web.expasy.org/compute_pi/)。
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图 1 SlCDJ2基因核酸凝胶电泳图 |
将转pET-SlCDJ2融合质粒的大肠杆菌阳性菌株，进行IPTG诱导6h后，将样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果显示在大肠杆菌中有一条大约34kDa的带，诱导后的蛋白为连有组氨酸标签的融合蛋白(图 2)。这个结果说明SlCDJ2蛋白能在大肠杆菌中经诱导表达。
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图 2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 1：pET-SlCDJ2未经IPTG诱导；2-7：分别经IPTG诱导1~6h；M：蛋白Maker |
将结果2.1中获得的转pET30a-SlCDJ2阳性菌株和转pET30a空载菌株在甘露醇模拟的干旱胁迫下，进行持续26h诱导表达，分别在1、2、4、6、8、10、12、24h和26h时间点取样检测。结果如图 3显示：在没有胁迫条件下(0mM甘露醇)，转基因菌株和对照菌株的生长情况没有明显差异(图 3A)。在干旱胁迫条件下，转基因菌株的生长状况明显好于对照菌株(图 3B、3C、3D)，只是随着胁迫程度的加深，转基因菌株和对照菌株生长情况均在变差。在进行盐胁迫处理时，如结果图 4显示：与干旱胁迫的结果极其相似(图 4A、4B、4C、4D)。只是盐胁迫对转基因和对照菌株生长的影响明显大于干旱胁迫。总之，将番茄SlCDJ2蛋白在大肠杆菌中进行表达，增强了转基因大肠杆菌对渗透胁迫的抗性。
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图 3 干旱胁迫对转SlCDJ2基因的大肠杆菌生长的影响(Mean ± SE，n=6) **代表与对照组相比存在显著差异(*P < 0.05，**P < 0.01) |
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图 4 盐胁迫对转SlCDJ2基因的大肠杆菌生长的影响(x±s，n=6) *代表与对照组相比存在显著差异(P < 0.05) |
为了进一步探究SlCDJ2在酵母中是否具有与在大肠杆菌中同样的功能，我们构建了pYES2-SlCDJ2酵母表达载体，并成功转化酵母，获得阳性菌株。如图 5显示：不论是在干旱胁迫下还是盐胁迫下，转pYES2-SlCDJ2的酵母菌株均比转pYES2空载的对照菌株菌落密度要大，只是随着胁迫程度加大，阳性菌株和对照菌株的菌落密度均在逐渐减小，这就说明阳性菌株的生长状况要优于对照菌株的生长状况。这些结果说明，SlCDJ2蛋白有助于增强转基因酵母对渗透胁迫的抗性。
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图 5 干旱和盐胁迫对转SlCDJ2基因酵母生长的影响 |
DnaJ蛋白是生物体内广泛存在的一种参与多种生理生化过程，并响应多种胁迫的热激蛋白，最早发现于大肠杆菌中[7]。近几年，几乎在所有的生物类群中均有DnaJ蛋白的发现，且具有多种不同的生物特征[8]。Hsp70-DnaJ分子伴侣系统能够维持多种胁迫下细胞内蛋白质的稳定，进而提高生物体的抗逆性[9]。例如AtDjA2和AtDjA3蛋白有助于提高拟南芥的高温抗性[10]。AtDjB1可以通过保护细胞免受高温诱导的氧化胁迫的伤害，进而提高拟南芥的耐热性[11]。异源表达大豆GmDjp1能够显著提高大肠杆菌的高温抗性[12]。Schafleitner等[13]研究发现6个DnaJ蛋白均受到水分胁迫的诱导而上调表达，其作用可能是维持干旱胁迫下细胞内蛋白组分的稳定性，从而减轻细胞的损伤。Zhao等[14]研究表明，在大肠杆菌中异源表达拟南芥DnaJ蛋白能够增强细菌对盐的耐受性。目前，番茄中DnaJ蛋白功能研究较少，尤其是对渗透胁迫条件下其功能研究更少。因此，本研究中我们从番茄叶片中克隆得到一个DnaJ基因(SlCDJ2)，该基因全长为1159 bp，开放阅读框为834 bp，编码277个氨基酸(图 1)。先前研究表明，番茄SlCDJ2基因受干旱胁迫的诱导表达[15]。在本研究中，在大肠杆菌中表达SlCDJ2蛋白(图 2)，转基因大肠杆菌在干旱和盐胁迫的生长状况明显好于对照菌株(图 3、4)，说明SlCDJ2蛋白有助于提高转基因大肠杆菌对渗透胁迫的抗性。同样，在酵母中表达SlCDJ2蛋白，转基因酵母菌株在干旱和盐胁迫下的菌落密度均高于对照菌株(图 5)，说明SlCDJ2蛋白有助于转基因酵母提高对渗透胁迫的抗性。这些研究初步表明，番茄SlCDJ2基因在响应渗透胁迫过程发挥重要的功能，但SlCDJ2基因在番茄中的具体功能仍有待进一步研究。
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