乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，严重危害女性的身心健康，已成为导致女性死亡的重要因素。PIWI是一类肿瘤相关基因，参与了包括乳腺癌在内的多种肿瘤的发生发展过程。PIWI基因家族有4个成员，即Piwil1(Piwi-like homolog1)、Piwil2、Piwil3和Piwil4。PIWIL1(PIWI-like protein 1，PIWIL1)是Argonaute蛋白家族的重要成员，在细胞增殖、肿瘤发生、胚胎发育等生物学过程中发挥重要的作用[1]。Sun等[2]研究发现，结肠癌组织中PIWIL1蛋白表达水平远远高于正常结肠组织，提示PIWIL1可作为检测结肠癌的重要的分子标记物。随着研究的不断深入，已发现多种分子在乳腺癌的发生过程中发挥重要的作用。CYP3A4是墨西哥女性乳腺癌发病的重要检测分子[3]。ESR1和PGR与乳腺导管癌的发生密切相关[4]，同时EMSY(一种新的BRCA2连接蛋白)参与了乳腺癌的淋巴结转移[5]。PIWIL的高表达与肿瘤的低分化和高转移率密切相关，甚至会导致周围神经侵袭[6]。胃癌组织高水平表达PIWIL，常被看作癌细胞生长的标志物[7]，而敲除PIWIL则会抑制裸鼠肺癌的生长[8]，这充分表明PIWIL参与了多种肿瘤发生，并可作为癌症治疗的潜在药物靶标。
本实验应用RNAi技术特异性沉默乳腺癌细胞株MCF-7中PIWIL1基因的表达，探讨PIWIL1基因的靶向抑制对乳腺癌细胞增殖的影响，为乳腺癌的早期基因诊断和治疗提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料乳腺癌MCF-7细胞株由本研究所培养保存，细胞培养所用胎牛血清和DMEM培养基均购自美国Gibco公司；SYBR Green Ⅰ购自罗氏公司；RNA提取试剂TRIzol和细胞转染试剂LipofectamineTM2000均购自Invitrogen公司；RT-PCR试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。针对目的基因PIWIL1的干扰质粒pGCsilencerTMH1/GFP/Neo/PIWIL1和对照质粒pGCsilencerTMH1/GFP/Neo/Non均由上海吉凯公司设计并构建。
1.2 靶向PIWIL1的shRNA表达载体的构建根据目的基因PIWIL1的mRNA序列(Accession number of PIWIL1 mRNA:AB079366)设计合成其靶向siRNA，并从中选择干扰效率最高的一条siRNA构建表达载体pGCsilencerTMH1/GFP/Neo/PIWIL1，该表达载体在脊椎动物细胞内表达针对PIWIL1的shRNA。同时设计合成一条非特异siRNA，构建阴性对照表达载体pGCsilencerTM H1/GFP/Neo/Non。
1.3 细胞培养人乳腺癌MCF-7细胞株常规培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中, 5% CO2，37℃条件下培养、传代。实验随机分为脂质体对照组，阴性质粒转染对照组(阴性对照组)及PIWIL1-shRNA)重组质粒转染组(PIWIL1-shRNA组)。
1.4 稳定转染细胞株的筛选MCF-7细胞接种于24孔板，24h后转染干扰质粒，48h后更换含有G418的DMEM培养基，每2~3天更换一次新鲜培养液，G418浓度由预实验确定。约10~15d后转染PIWIL1-shRNA组质粒的细胞多数死亡，未转染带有抗性基因质粒的细胞组全部死亡。最后，挑取阳性细胞克隆继续扩大培养，直至获得稳定转染的细胞。
1.5 PIWIL1 mRNA表达的检测为检测干扰质粒对目的基因表达水平的影响，对PIWIL1-shRNA组、阴性对照组和脂质体对照组各组细胞进行PIWIL1 mRNA表达水平检测。提取各组细胞总RNA，然后反转录成cDNA。利用软件Primer Premier 5.0设计PIWIL1和内参GAPDH引物，为避免基因组DNA的污染，上下游引物跨越2个内含子。PIWIL1：上游引物5′-TCACCTGAGCAAAGACAAC-3′，下游引物5′-TCCCGTAAAGGACAGTAAG-3′, 片段长度126bp；GAPDH：上游引物5′-CGATCTGAACTACATGGTTTAC-3′，下游引物5′-TCTGCCCATTTGATGTTGC-3′，片段长度151bp。按照试剂盒操作规程，运用实时荧光定量PCR检测各组细胞中PIWIL1 mRNA表达水平。以GAPDH作内参，用公式2Ct(GAPDH)-Ct(PIWIL1)计算目的基因mRNA相对表达量。
1.6 Western blot检测细胞中PIWIL1蛋白表达将培养于6孔细胞培养板中的MCF-7细胞去除培养基，预冷的PBS洗两遍。每孔加入200μl RIPA细胞裂解液(含1% PMSF)，置于冰上裂解30min，提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。10%的SDS-PAGE进行电泳分离、转膜。5%的脱脂蛋白室温封闭1h，TBST洗3次，10min/次；PIWIL1一抗4℃孵育过夜，TBST洗3次，10min/次；辣根过氧化物酶标记的二抗山羊抗兔IgG室温孵育1h，TBST洗3次，10min/次；ECL显色、X曝光。扫描仪扫描X光片上的条带，Image J2x软件进行条带的灰度值计算。所得结果用SPSS13.0进行统计分析，结果以3次独立实验的x±s表示。
1.7 CCK-8(Cell Counting Kit-8)检测细胞增殖活性将脂质体对照组、PIWIL1-shRNA组和阴性对照组等各组MCF-7细胞接种于96孔培养板中，细胞密度为104个/孔，CO2培养箱常规培养。24h后，每孔加入10μL CCK-8溶液；细胞培养箱内继续孵育1h；在450nm测定吸光度。实验重复3次。
1.8 统计学方法数据用SPSS18.0软件进行统计分析，采用方差分析进行多组间比较，采用SNK-q检验进一步两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 PIWIL1-shRNA表达载体的构建与鉴定阳性干扰质粒pGCsilencerTMH1/GFP/Neo/PIWIL1和阴性对照重组质粒构建后经测序证实100%靶向目的基因，同时该载体在细胞内可表达用于筛选的GFP蛋白，表明该重组质粒构建成功。见图 1。
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图 1 RNAi质粒构建图谱 注：A.pGCsilencerTMH1/GFP/Neo/NON RNAi质粒图谱; B.pGCsilencerTMH1/GFP/Neo/PIWIL1 RNAi质粒图谱 |
含阳性重组质粒的MCF-7细胞株在经过G418抗性筛选后，细胞爬片，荧光显微镜观察，证实已成功获得稳定转染的阳性细胞克隆，可用于后续实验。见图 2。
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图 2 MCF-7稳转细胞的筛选及鉴定 注：A.稳定转染pGCsilencerTMH1/GFP/Neo/ PIWIL1质粒的MCF-7细胞在普通显微镜下的生长状态；B.稳定转染pGCsilencerTMH1/GFP/Neo/ PIWIL1质粒的MCF-7细胞在荧光显微镜下的生长状态 |
PCR扩增后DNA电泳结果显示，PIWIL1和内参GAPDH大小与实际大小一致，表明MCF-7细胞内源性表达PIWIL1 mRNA，且PCR对2种基因进行了特异性扩增。见图 3。
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图 3 Real-time PCR扩增后PIWIL1和GAPDH电泳图 |
PIWIL1-shRNA重组质粒转染MCF-7细胞后，目的基因PIWIL1 mRNA的表达水平受到了显著的抑制，mRNA表达水平比脂质体对照组降低了73.9%。阴性对照组和脂质体对照组MCF-7细胞的PIWIL1 mRNA表达水平无显著性差异。见表 1。
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表 1 稳定转染后各组细胞PIWIL1 mRNA的相对抑制率 |
PIWIL1-shRNA组PIWIL1蛋白表达显著低于脂质体对照组和阴性对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)，而阴性对照组和脂质体对照组间无统计学差异。见图 4。
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图 4 PIWIL1-shRNA对MCF-7细胞中PIWIL1蛋白表达水平的影响 注：3组间比较，F=51.18，P＜0.05;与脂质体对照组及阴性对照组比较，**P＜0.05，n=6；与脂质体对照组相比，*P＞0.05, n=6 |
PIWIL1-shRNA质粒转染MCF-7细胞后，PIWIL1-shRNA细胞增殖活性显著低于阴性对照组和脂质体对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)，而阴性对照组和脂质体对照组间没有差异。
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图 5 PIWIL1-shRNA对MCF-7细胞活性的影响 注：3组间比较，F=40.65，P＜0.05;与脂质体对照组及阴性对照组比较，**P＜0.05，n=6；与脂质体对照组相比，*P＞0.05, n=6 |
PIWI是人类Argonaute蛋白家族重要成员，而Argonaute蛋白是RNA介导的干扰复合物的中心成分。PIWI参与了几乎所有的生物学过程，并且与多种恶性肿瘤的发生密切相关[9]。作为PIWI蛋白亚家族成员，PIWIL1广泛分布于前列腺、卵巢、乳腺、肝脏、心脏等多种人体组织中，在细胞增殖、凋亡、粘附、转移和肿瘤的发生等生物学过程中发挥了关键的作用[10-11]。
本实验中，我们首先根据siRNA设计原则，针对PIWIL1基因设计了3条siRNA和1条阴性对照siRNA，通过筛选优化得到了一条干扰效果最佳的siRNA，随后用这条siRNA构建了PIWIL1-shRNA表达质粒，用以筛选稳转细胞和后期的动物实验。该表达质粒除可高效表达shRNA，还可表达GFP和Neo 2种蛋白，用以检测转染效率和进行抗性筛选，扩大培养。
稳转细胞株的筛选，我们选用了G418抗性筛选方法。荧光显微镜检测结果显示，转染PIWIL1-shRNA质粒的MCF-7细胞经过抗性筛选后稳定高效表达绿色荧光蛋白，且PIWIL1主要在细胞质中表达，表明稳定表达PIWIL1-shRNA质粒和阴性对照质粒的MCF-7细胞株筛选成功，为后续实验的顺利实施奠定了研究基础。随后，我们从mRNA水平和蛋白水平对稳转细胞中PIWIL1基因的表达进行了检测。实时荧光定量PCR结果显示，转染PIWIL1-shRNA质粒的MCF-7细胞，PIWIL1 mRNA的表达受到了明显的抑制，与脂质体对照组相比，mRNA表达水平降低了73.9%。而转染阴性对照质粒的MCF-7细胞和脂质体对照组相比，PIWIL1 mRNA的表达水平无显著性差异，表明PIWIL1-shRNA显著抑制了PIWIL1 mRNA的表达。同样，蛋白免疫印迹结果显示，PIWIL1-shRNA组的蛋白表达水平显著低于脂质体对照组和阴性对照组(P＜0.05)，表明PIWIL1-shRNA不仅抑制了PIWIL1基因的mRNA的表达，进而还引起了PIWIL1蛋白表达的降低。
研究表明，PIWIL1参与了多种恶性肿瘤的发生发展。PIWIL1的异常表达促进了结肠癌细胞的增殖，还可通过上调DNA的甲基化影响癌细胞的活性[12-13]。肺癌细胞增殖活性的激活同样依赖PIWIL1基因的过表达[14]，因此，PIWIL1常被作为多种恶性肿瘤早期诊断和预后的标志物[2, 15]。本实验中，PIWIL1-shRNA重组质粒的转染抑制了乳腺癌细胞MCF-7中PIWIL1 mRNA和蛋白的表达。为检测基因水平的变化是否会影响细胞的增殖，我们运用CCK-8方法进行了细胞增殖活性检测。实验结果显示，PIWIL1-shRNA组细胞的增殖活性显著低于脂质体组和阴性对照组细胞(P＜0.05)，表明PIWIL1表达水平的降低抑制了细胞的增殖，进而也说明PIWIL1能够促进MCF-7细胞的增殖，具有促进乳腺癌增殖的潜力，是一种促癌基因。
综上所述，我们运用RNAi和实时荧光定量等方法，证实在对乳腺癌细胞MCF-7中的PIWIL1进行沉默后，PIWIL1 mRNA和蛋白表达显著降低。CCK-8细胞活性分析实验表明，PIWIL1能够促进乳腺癌细胞MCF-7的增殖，提示PIWIL1是一种肿瘤促进基因，为乳腺癌的早期诊断和治疗提供了新的思路，为抗癌药物的设计和研究提供了新的实验依据。
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