牛蒡(Arctium lappa L)，又称东洋参、恶实，是桔梗目菊科牛蒡属的二年生草本植物^[1]。牛蒡在我国东北、华北、西北以及华东、华中、西南部分地区均有种植，主要产地分布于苏、鲁两省，其中以江苏徐州和山东临沂居多^[2]。

牛蒡中的功能成分赋予牛蒡极高的保健价值，经常食用可促循环、清肠胃、防衰老、降血糖、抗氧化^[3]。其中绿原酸具有抗氧化、抗过敏、抗致畸、抗肿瘤细胞株毒活性、抗艾滋病毒等作用，并能有效抑制多种致病菌^[4-7]。

目前市面上牛蒡产品种类繁多，常见的有牛蒡茶、牛蒡酒、牛蒡酱和牛蒡罐头等^[8]。测定牛蒡及其制品绿原酸含量对于提高牛蒡利用价值，改进牛蒡加工工艺，对居民合理膳食具有一定的指导意义。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 原料

牛蒡、牛蒡酱、牛蒡酒、牛蒡咸菜、牛蒡胶囊和三种牛蒡茶(市售，产地均为山东省临沂市兰陵县)。

1.1.2 仪器

数显式三用电热恒温水浴箱(上海跃进医疗器械有限公司，型号S·HH·W21·600)、超声波清洗机(宁波新艺超声波设备有限公司，型号SB-3200DTS)、电子分析天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司，型号FB323)、高效液相色谱仪(美国Agilent，型号1260 Infinity)。

1.1.3 试剂

绿原酸标准品(纯度≥99%)、乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)、乙酸(优级纯)、超纯水。

绿原酸标准储备液(2.00mg/ml)：精确称取绿原酸标准品0.0200g加流动相定容至10ml(棕色瓶保存，现用现配)。

绿原酸标准使用液(200μg/ml)：准确量取1.00ml绿原酸标准储备液于10ml容量瓶中，用流动相定容至刻度(置于棕色瓶中，现用现配)。

1.2 方法 1.2.1 样品溶液的制备

精确称取0.5000g固体样品，充分研磨后，用70%甲醇溶液(50ml)转移入圆底烧瓶，称重，记为m₁。60℃回流30min，擦干外壁，冷却至室温，再称重，记为m₂。用70%甲醇溶液补足m₁-m₂，混匀后过滤，滤液过0.45μm滤膜备用。液体试样3000r/min离心10min后过0.45μm滤膜备用^[9]。

1.2.2 标准曲线的制备

吸取绿原酸标准使用液0.25、0.50、1.00、2.00、4.00ml分别置于10ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，配置成标准系列。

1.2.3 色谱分析

取标准溶液和试样溶液分别注入高效液相色谱仪配套的棕色进样瓶，以保留时间定性，以试样峰面积与标准使用液比较定量，进样分析。

1.2.4 色谱条件

C18色谱柱(5μm, 4.6nm×250nm)；流动相：乙腈，0.5%乙酸(10:90)；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；检测波长：327nm；进样量：10μl。

1.2.5 公式

$ {\rm{X}} = \frac{{c \times V \times 1000}}{{m \times 1000 \times 1000}} $

式中：X，试样中绿原酸含量，g/kg或g/l；c，由标准曲线求得进样溶液中的绿原酸浓度，μg/ml；V，试样定容体积，ml；m，试样质量或体积，g或ml。计算结果保留3位有效数字。

1.2.6 方法学考察 1.2.6.1 精密度试验

取牛蒡样品溶液于进样瓶中，连续进样6次进行测定。

1.2.6.2 稳定性试验

将牛蒡样品溶液移入6只不同的进样瓶中，分别于0、1、2、4、6、8h进样，同时记录峰面积并计算出绿原酸含量。

1.2.6.3 重复性试验

取同一规格牛蒡研磨充分，精确称量6份，每份0.5g(精确到0.0001)。按上述样品制备方法得到样品溶液，测定每一份试样中的绿原酸含量。

1.2.6.4 回收率试验

精确称取6份牛蒡粉末，每份0.5g(精确到0.0001)，分别加入绿原酸标准品0.0038g，按以上方法制备供试液，并测定每一份样品中的绿原酸含量。

2 结果 2.1 标准曲线的绘制

以试样浓度为横坐标，峰面积分值为纵坐标绘制标准工作曲线，得到回归方程为Y=24.68482X-11.33665，r=0.99989。结果表明绿原酸含量在5.0~80.0μg/ml范围内，试样浓度与峰面积之间线性关系良好。见表 1、图 1。

2.2 样品中绿原酸含量测定结果

牛蒡、牛蒡酱、牛蒡酒、牛蒡咸菜、牛蒡胶囊和3种牛蒡茶的绿原酸色谱图。见图 2A~H。

牛蒡中的绿原酸含量最高，为7.57g/kg。三种牛蒡茶中绿原酸含量较高，其中特级牛蒡茶的绿原酸含量仅次于鲜牛蒡，为5.96g/kg，牛蒡茶片绿原酸含量与特级牛蒡茶接近，为5.29g/kg，二者加工损失率分别为21.3%和30.1%，而牛蒡茶丝加工损失率高达59.6%。牛蒡胶囊中绿原酸含量仅为2.32×10^-3g/L，牛蒡酱、牛蒡酒和牛蒡咸菜中未检出绿原酸。见表 2。

2.3 方法学试验结果 2.3.1 精密度试验结果

由精密度试验结果可以看出，RSD为0.66%，表明仪器检测系统的精密度良好。见表 3。

2.3.2 稳定性试验结果

根据稳定性试验结果可以看出，RSD为1.06%，表明样品溶液在8h内稳定性好。见表 4。

2.3.3 重复性试验结果

重复性试验结果见表 5，RSD为0.72%，表明该法的重现性较好。

2.3.4 回收率试验结果

上一步已测得绿原酸含量为3.76mg，计算加标回收率，结果见表 6。由表中数据可知，平均回收率为99.2%，RSD为1.14%，表明该法的回收率良好。

本试验方法操作简单，准确度高，重现性好，可用于牛蒡及其制品中绿原酸含量的测定。经测定发现牛蒡中绿原酸含量最高，各种加工制品中绿原酸含量均有损失。

3 讨论

本文发现牛蒡中绿原酸含量最高，各种加工方式都会造成绿原酸含量的损失，温度对绿原酸损失率影响较大^[10]。牛蒡茶制品相较于其他牛蒡制品绿原酸损失较少，是由于加工工艺简单，加工温度较低，因此能较大程度保留其中的绿原酸。本试验选取了三种市售牛蒡茶，其中牛蒡茶丝和牛蒡茶片仅外观不同，加工均采取分割后干燥处理。同等处理条件下，丝状比片状更易升温失水，里面的活性成分更易受温度影响而发生变化，因此, 绿原酸损失率更大。特级牛蒡茶采用发酵工艺，严格的温度控制最大程度地保留了里面的活性成分，同时在微生物和酶的共同作用下可能会促进绿原酸生成，可通过进一步试验进行验证。牛蒡胶囊中绿原酸含量为2.32×10^-3g/L，因为在加工时需经过高温提取、蒸馏浓缩等一系列过程，绿原酸遭到了破坏。牛蒡酱和牛蒡咸菜在熟制过程中，经热油加热至150℃以上的高温，造成绿原酸大量损失。牛蒡酒经发酵、蒸馏、酿制而成，长时间的高温会破坏绿原酸。因此，在牛蒡加工时应尽可能采用较低的温度，并减少受热时间，以避免绿原酸大量损失。目前市面上许多主打保健功能的牛蒡制品，其功效到底如何，有待进一步商榷。