牛蒡(Arctium lappa L),又称东洋参、恶实,是桔梗目菊科牛蒡属的二年生草本植物[1]。牛蒡在我国东北、华北、西北以及华东、华中、西南部分地区均有种植,主要产地分布于苏、鲁两省,其中以江苏徐州和山东临沂居多[2]。
牛蒡中的功能成分赋予牛蒡极高的保健价值,经常食用可促循环、清肠胃、防衰老、降血糖、抗氧化[3]。其中绿原酸具有抗氧化、抗过敏、抗致畸、抗肿瘤细胞株毒活性、抗艾滋病毒等作用,并能有效抑制多种致病菌[4-7]。
目前市面上牛蒡产品种类繁多,常见的有牛蒡茶、牛蒡酒、牛蒡酱和牛蒡罐头等[8]。测定牛蒡及其制品绿原酸含量对于提高牛蒡利用价值,改进牛蒡加工工艺,对居民合理膳食具有一定的指导意义。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 原料牛蒡、牛蒡酱、牛蒡酒、牛蒡咸菜、牛蒡胶囊和三种牛蒡茶(市售,产地均为山东省临沂市兰陵县)。
1.1.2 仪器数显式三用电热恒温水浴箱(上海跃进医疗器械有限公司,型号S·HH·W21·600)、超声波清洗机(宁波新艺超声波设备有限公司,型号SB-3200DTS)、电子分析天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司,型号FB323)、高效液相色谱仪(美国Agilent,型号1260 Infinity)。
1.1.3 试剂绿原酸标准品(纯度≥99%)、乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)、乙酸(优级纯)、超纯水。
绿原酸标准储备液(2.00mg/ml):精确称取绿原酸标准品0.0200g加流动相定容至10ml(棕色瓶保存,现用现配)。
绿原酸标准使用液(200μg/ml):准确量取1.00ml绿原酸标准储备液于10ml容量瓶中,用流动相定容至刻度(置于棕色瓶中,现用现配)。
1.2 方法 1.2.1 样品溶液的制备精确称取0.5000g固体样品,充分研磨后,用70%甲醇溶液(50ml)转移入圆底烧瓶,称重,记为m1。60℃回流30min,擦干外壁,冷却至室温,再称重,记为m2。用70%甲醇溶液补足m1-m2,混匀后过滤,滤液过0.45μm滤膜备用。液体试样3000r/min离心10min后过0.45μm滤膜备用[9]。
1.2.2 标准曲线的制备吸取绿原酸标准使用液0.25、0.50、1.00、2.00、4.00ml分别置于10ml容量瓶中,加流动相稀释至刻度,配置成标准系列。
1.2.3 色谱分析取标准溶液和试样溶液分别注入高效液相色谱仪配套的棕色进样瓶,以保留时间定性,以试样峰面积与标准使用液比较定量,进样分析。
1.2.4 色谱条件C18色谱柱(5μm, 4.6nm×250nm);流动相:乙腈,0.5%乙酸(10:90);流速:1.0ml/min;柱温:35℃;检测波长:327nm;进样量:10μl。
1.2.5 公式$ {\rm{X}} = \frac{{c \times V \times 1000}}{{m \times 1000 \times 1000}} $ |
式中:X,试样中绿原酸含量,g/kg或g/l;c,由标准曲线求得进样溶液中的绿原酸浓度,μg/ml;V,试样定容体积,ml;m,试样质量或体积,g或ml。计算结果保留3位有效数字。
1.2.6 方法学考察 1.2.6.1 精密度试验取牛蒡样品溶液于进样瓶中,连续进样6次进行测定。
1.2.6.2 稳定性试验将牛蒡样品溶液移入6只不同的进样瓶中,分别于0、1、2、4、6、8h进样,同时记录峰面积并计算出绿原酸含量。
1.2.6.3 重复性试验取同一规格牛蒡研磨充分,精确称量6份,每份0.5g(精确到0.0001)。按上述样品制备方法得到样品溶液,测定每一份试样中的绿原酸含量。
1.2.6.4 回收率试验精确称取6份牛蒡粉末,每份0.5g(精确到0.0001),分别加入绿原酸标准品0.0038g,按以上方法制备供试液,并测定每一份样品中的绿原酸含量。
2 结果 2.1 标准曲线的绘制以试样浓度为横坐标,峰面积分值为纵坐标绘制标准工作曲线,得到回归方程为Y=24.68482X-11.33665,r=0.99989。结果表明绿原酸含量在5.0~80.0μg/ml范围内,试样浓度与峰面积之间线性关系良好。见表 1、图 1。
![]() |
表 1 绿原酸标准曲线测定结果 |
![]() |
图 1 绿原酸标准曲线 |
牛蒡、牛蒡酱、牛蒡酒、牛蒡咸菜、牛蒡胶囊和3种牛蒡茶的绿原酸色谱图。见图 2A~H。
![]() |
图 2 牛蒡及其加工制品高效液相色谱图 注:A.牛蒡;B.牛蒡酱;C.牛蒡酒;D.牛蒡咸菜;E.牛蒡胶囊;F.牛蒡茶丝;G.牛蒡茶片;H.特级牛蒡茶 |
牛蒡中的绿原酸含量最高,为7.57g/kg。三种牛蒡茶中绿原酸含量较高,其中特级牛蒡茶的绿原酸含量仅次于鲜牛蒡,为5.96g/kg,牛蒡茶片绿原酸含量与特级牛蒡茶接近,为5.29g/kg,二者加工损失率分别为21.3%和30.1%,而牛蒡茶丝加工损失率高达59.6%。牛蒡胶囊中绿原酸含量仅为2.32×10-3g/L,牛蒡酱、牛蒡酒和牛蒡咸菜中未检出绿原酸。见表 2。
![]() |
表 2 样品中绿原酸含量测定结果 |
由精密度试验结果可以看出,RSD为0.66%,表明仪器检测系统的精密度良好。见表 3。
![]() |
表 3 精密度试验结果 |
根据稳定性试验结果可以看出,RSD为1.06%,表明样品溶液在8h内稳定性好。见表 4。
![]() |
表 4 稳定性试验结果 |
重复性试验结果见表 5,RSD为0.72%,表明该法的重现性较好。
![]() |
表 5 重复性试验结果 |
上一步已测得绿原酸含量为3.76mg,计算加标回收率,结果见表 6。由表中数据可知,平均回收率为99.2%,RSD为1.14%,表明该法的回收率良好。
![]() |
表 6 回收率试验结果 |
本试验方法操作简单,准确度高,重现性好,可用于牛蒡及其制品中绿原酸含量的测定。经测定发现牛蒡中绿原酸含量最高,各种加工制品中绿原酸含量均有损失。
3 讨论本文发现牛蒡中绿原酸含量最高,各种加工方式都会造成绿原酸含量的损失,温度对绿原酸损失率影响较大[10]。牛蒡茶制品相较于其他牛蒡制品绿原酸损失较少,是由于加工工艺简单,加工温度较低,因此能较大程度保留其中的绿原酸。本试验选取了三种市售牛蒡茶,其中牛蒡茶丝和牛蒡茶片仅外观不同,加工均采取分割后干燥处理。同等处理条件下,丝状比片状更易升温失水,里面的活性成分更易受温度影响而发生变化,因此, 绿原酸损失率更大。特级牛蒡茶采用发酵工艺,严格的温度控制最大程度地保留了里面的活性成分,同时在微生物和酶的共同作用下可能会促进绿原酸生成,可通过进一步试验进行验证。牛蒡胶囊中绿原酸含量为2.32×10-3g/L,因为在加工时需经过高温提取、蒸馏浓缩等一系列过程,绿原酸遭到了破坏。牛蒡酱和牛蒡咸菜在熟制过程中,经热油加热至150℃以上的高温,造成绿原酸大量损失。牛蒡酒经发酵、蒸馏、酿制而成,长时间的高温会破坏绿原酸。因此,在牛蒡加工时应尽可能采用较低的温度,并减少受热时间,以避免绿原酸大量损失。目前市面上许多主打保健功能的牛蒡制品,其功效到底如何,有待进一步商榷。
[1] |
窦培元, 栾晓宁, 朱连连, 等. 牛蒡根中有效成分的含量测定[J]. 山西中医学院学报, 2018, 19(4): 30-33. |
[2] |
张嫚, 李爽, 万国福, 等. 响应面法优化牛蒡中绿原酸提取分离条件[J]. 食品研究与开发, 2017, 38(24): 32-36. DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2017.24.007 |
[3] |
朱连连, 栾晓宁, 窦德强. 牛蒡根固体茶制剂中功能性成分含量测定[J]. 辽宁中医药大学学报, 2019, 21(2): 66-69. DOI:10.13194/j.issn.1673-842x.2019.02.017 |
[4] |
Hou B, Wang WC, Gao H, et al. Effects of aqueous extract of Arctium lappa L.roots on serum lipid metabolism[J]. J Int Med Res, 2018, 46(1): 158-167. DOI:10.1177/0300060517716341 |
[5] |
Chen WC, Hsu YJ, Lee MC, et al. Effect of burdock extract on physical performance and physiological fatigue in mice[J]. J Vet Med Sci, 2017, 79(10): 1698-1706. DOI:10.1292/jvms.17-0345 |
[6] |
Hwang SH, Paek JH, Lim SS. Simultaneous ultra performance liquid chromatography determination and antioxidant activity of linarin, luteolin, chlorogenic acid and apigenin in different parts of compositae species[J]. Molecules, 2016, 21(11): E1609. DOI:10.3390/molecules21111609 |
[7] |
王玲娜, 姚佳欢, 马超美. 绿原酸的研究进展[J]. 食品与生物技术学报, 2017, 36(11): 1121-1130. DOI:10.3969/j.issn.1673-1689.2017.11.001 |
[8] |
Lee D, Kim CY. Influence of roasting treatment on the antioxidant activities and color of burdock root tea[J]. Prev Nutr Food Sci, 2017, 22(1): 21-29. DOI:10.3746/pnf.2017.22.1.21 |
[9] |
Cao TL, Yang SY, Song KB. Development of burdock root Inulin/Chitosan blend films containing oregano and thyme essential oils[J]. Int J Mol Sci, 2018, 19(1): E131. DOI:10.3390/ijms19010131 |
[10] |
张爱丽, 刘德军, 苟琼心. 银翘解毒丸制备工艺中绿原酸转移率的影响因素研究[J]. 药物评价研究, 2016, 39(1): 92-96. DOI:10.7501/j.issn.1674-6376.2016.01.017 |