2. 济宁医学院公共卫生学院, 济宁 272067;
3. 山东省医学科学院山东省职业卫生与职业病防治研究院, 济南 250062
2. School of Public Health, Jining Medical University, Jining 272067, China;
3. Shandong Academy of Occupational Health and Occupational Medicine, Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan 250062, China
手臂振动病作为一种常见的职业病，主要危害作业工人的周围神经、周围循环以及骨关节肌肉系统的功能。其中振动所致骨关节肌肉系统的损伤表现，常不如神经及循环功能损害的表现明显[1-2]，因此在实际防治工作中容易被忽略。然而，振动性骨关节肌肉损伤常可影响工人的手部功能，给其工作和生活带来较大影响，并有一定的致残率[3-4]。以往的研究多认为振动性骨骼肌损伤的主要原因在于神经损伤的继发改变，但其确切机制尚未阐明。线粒体作为细胞能量代谢的重要结构，是决定骨骼肌功能的重要因素，许多研究证实，在运动导致的骨骼肌的损伤中，均可见线粒体的异常或相关生化指标的改变[5-6]。本研究对接振家兔骨骼肌能量代谢相关的生化指标进行了测定与分析，旨在为振动性骨骼肌损伤的机制及其防治研究提供基础资料。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 动物及分组选择同2个月龄左右新西兰白兔(由新华鲁抗实验动物中心提供)作为实验对象，共32只，体重为2.0~3.0 kg，雌雄各半。将家兔随机分为低强度组、中强度组、高强度组3个实验组和1个对照组，每组8只。动物管理均遵循国家实验动物饲养管理条例和使用指南以及济宁医学院实验动物管理条例。
1.1.2 仪器及试剂D-150-1电动振动台，D-150-1振动控制仪(苏州试验仪器厂)；RC5C高速冷冻离心机(美国科峻仪器公司)；ND2型精密声级计(江西红声器材厂)；线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司)；ATP酶测试盒测试盒(南京建成生物工程研究所)。
1.2 方法 1.2.1 振动负荷试验家兔固定于自制铁质固定器上，双后肢密切接触D-150-1电动振动台面，由KD-3振动控制仪调控振动参数。在振动负荷试验过程中，将对照组置于中强度组相同的环境中，只接触噪声不接触振动，以消除噪声对实验的干扰。实验组总实验时间均为45d。分组、接振强度、接振时间、接振时噪声水平见表 1。
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表 1 各组振动负荷试验的振动强度、振动时间 |
振动负荷试验结束后，取家兔小腿远端骨骼肌，立即贮存于-70℃冰箱中待测。
1.2.3 指标的测定1) 线粒体呼吸链酶复合体活力的测定。根据试剂盒说明书步骤进行，将骨骼肌研磨匀浆后，经过2次离心，获得线粒体，再经超声波破碎线粒体后，加反应液，应用分光光度法分别在波长340、605、550、550nm处测定线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的吸光度值并记录。根据公式按照湿重质量计算线粒体呼吸链酶活力单位。计算公式：线粒体呼吸链酶活力单位(μmol·mgprot-1·min-1)=[(△A /min·反应体积)/吸光系数]/线粒体蛋白含量。应用Folin-酚法进行线粒体蛋白浓度的测定。2)ATP酶活力的测定。将所取家兔骨骼肌组织匀浆，并制成10%组织匀浆液。用分光光度法测定Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力，以每小时每毫克组织蛋白的组织中ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷的量作为1个ATP酶活力单位(μmolPi·mgprot-1·h-1)。考马斯亮蓝法测定骨骼肌组织中蛋白质的含量。
1.3 统计学方法应用SPSS 20.0数据处理软件对结果进行统计描述和统计学处理。
2 结果 2.1 动物一般情况3个实验组家兔均出现不同程度的摄食量减少、活动减少、体重下降、脱毛增多的情况，且随实验时间的延长而加重，并以高强度组为甚。对照组在实验过程中无明显变化。
2.2 各组骨骼肌线粒体呼吸链酶复合体活力测定各组骨骼肌线粒体复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活力差异均有统计学意义(P < 0.05)。与对照组比较，各实验组家兔骨骼肌线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ~Ⅳ的活力均明显减弱(P < 0.05)。见表 2。
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表 2 各组骨骼肌线粒体呼吸链酶复合体活力(μmol·mgprot-1·min-1，x±s) |
经方差分析，4组骨骼肌组织中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力比较具有显著性差异性(P < 0.05)。与对照组比较，3个实验组Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力均明显降低(P < 0.05)。见表 3。
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表 3 各组骨骼肌组织ATP酶活力分析(μmolPi·mgprot-1·h-1，x±s) |
线粒体存在于大多数真核细胞中，主要承担组织细胞氧化供能的作用，是细胞进行有氧呼吸的主要场所。线粒体呼吸链电子传递过程伴有ATP生成[7]，这个电子传递链由线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ构成。线粒体呼吸链主要有两条，一是NADH氧化呼吸链(复合体Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ参与)，二是琥珀酸氧化呼吸链(复合体Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ参与)。复合体Ⅰ(NADH脱氢酶)将代谢物脱下的H经NADH传递给CoQ，同时将4个质子从基质泵出到膜间隙，复合体Ⅱ(琥珀酸脱氢酶)将电子从琥珀酸传递给CoQ，复合体Ⅲ(CoQ-细胞色素C还原酶)将电子从CoQ传递给细胞色素C，同时将4个质子释放至膜间隙，复合体Ⅳ(细胞色素C氧化酶)将电子从细胞色素C传递给O2，生成水，并产生ATP[8]。因此，当线粒体呼吸链酶被破坏时，这些连续的反应将会减弱甚至消失，导致骨骼肌能量代谢障碍，氧化磷酸化不能正常进行，不能达到细胞正常的代谢需求，使其功能出现异常[9-12]。
Na+-K+-ATP酶即钠钾泵，是存在于细胞膜上的蛋白质，其主要作用是依赖ATP，进行细胞内外钠与钾的交换，以维持细胞内高钾及细胞外高钠的生理性分布[13]。Ca2+-Mg2+-ATP酶即钙泵，它催化细胞膜或细胞质膜内侧ATP水解释放能量，以维持细胞内外或内质网内外钙的生理性不平衡。可见，这两种酶的作用发挥均需要充足能量(ATP)，或者说，若组织细胞的能量代谢发生异常，均可影响到两种酶的活性，进而影响细胞的功能[14]。
本文结果显示，经过振动负荷试验，各实验组家兔后肢骨骼肌线粒体呼吸链酶链复合体Ⅰ~Ⅳ的活力均呈显著下降的趋势，提示NADH氧化呼吸链与琥珀酸氧化呼吸链的功能均出现了异常，其后果即为骨骼肌线粒体ATP产量下降。产生这种结果的原因可能与以下因素有关：1)振动对机体的主要损害为周围动脉的收缩痉挛，导致肢端骨骼肌组织的缺血缺氧，而在低氧的环境下，对缺氧较为敏感的线粒体功能受到影响，其呼吸链酶链复合体Ⅰ~Ⅳ也出现功能异常和活力下降，同时复合体Ⅳ将电子从细胞色素C传递给O2时，ATP的产量也下降。2)振动为高强度的机械运动，它可以直接作用于骨骼肌组织[15-18]，使其细胞及细胞器(如线粒体)的形态结构现异常，从而影响与线粒体功能相关的呼吸链酶链复合体的活力。3)振动可导致某些细胞因子、炎症因子、血管内皮活性物质的改变[19-22]，这些因素也可能直接或间接作用于线粒体呼吸链酶，使其功能异常。同时，本文结果还显示，振动负荷试验后各实验组Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活力下降，并以高强度组为甚。这两种酶功能的实现，均依赖于ATP，当因线粒体呼吸链酶复合体活力下降而导致ATP生成下降时，Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活力必然会相应下降，从而影响到骨骼肌的功能[23]。在长期从事手传振动作业的工人中出现手臂部肌力下降、肌肉萎缩等，可能与此有直接的关系。
本文从能量代谢的角度探讨了振动导致骨骼肌损伤的原因和机制，振动对骨骼肌线粒体呼吸链酶链复合体Ⅰ~Ⅳ活力的影响是全面性的，所导致的是呼吸链酶功能的整体下降，可见其对线粒体的呼吸功能的影响较为严重而广泛，同时复合体Ⅰ和复合体Ⅳ活力下降又最明显。这为振动性骨骼肌损伤的防治提供了重要依据，即应以降低振动强度、避免骨骼肌受损为主要预防措施，一旦骨骼肌出现功能障碍和萎缩，其结局可能是不可逆性。
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