目前，肺癌是最常见的呼吸系统恶性肿瘤，研究发现肺癌拥有所有癌症中最高的死亡率，其死亡人数约占所有癌症的26%^[1]。随着科学技术的不断进步，越来越多的治疗手段应用于肺癌，从化疗到靶向治疗再到免疫治疗^[2]。虽然治疗方法在不断丰富，但医务工作者依然在努力寻找肺癌早期的诊断及治疗标志，从而完全攻克癌症。随着对表观遗传学的深入研究，我们发现表观遗传学的改变对于肺癌的发生起到不可替代的作用^[3]。p14在细胞生长过程中起到抑癌基因的作用^[4]，而p14ARF基因启动子区域异常甲基化在肺癌与癌旁组织存在明显差异，提示p14ARF基因启动子区域异常甲基化与肺癌的发生发展有着密切的关系^[5]。本实验利用巢式甲基化特异性PCR(NMSP)对spca1细胞系进行甲基化分析，并通过DAC去除p14ARF基因启动子区域异常甲基化，检测其对ARF蛋白表达及肿瘤细胞凋亡的影响，由此得出p14启动子区异常甲基化对肺癌生物学功能的影响，初步研究去除p14ARF基因启动子区域异常甲基化对肺癌生物学功能的影响。

人肺癌细胞系spca1、人支气管上皮细胞系beas-2b购自中科院上海细胞库；RPMI1640培养基、胎牛血清购自BI公司；胰蛋白酶、双抗、ANNEXIN V-FITC/PI凋亡检测试剂盒及cck8试剂盒购自Solarbio公司；5-氮杂-2脱氧胞苷购自MCE公司；兔抗人p14ARF、兔抗人β-actin抗体、羊抗兔IgG、RIPA蛋白裂解液等试剂均购自Abcam公司；DNA提取试剂盒TIANamp Genomic DNAKit、重亚硫酸修饰试剂盒、甲基化pcr试剂盒购自北京天根生化公司。

spca1培养于含有10%胎牛血清与1%青链霉素的RPMI1640培养基中，beas2b细胞培养于BEGM培养基中。培养箱条件为：5% CO₂、37℃、饱和湿度。

按TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒说明提取细胞DNA，并测纯度在1.8~2.0，用重亚硫酸盐修饰试剂盒对提取的基因组DNA进行修饰。将所有经亚硫酸氢盐转化的DNA样品储存在-20℃直至后续PCR。

根据细胞类型及是否进行去甲基化处理将细胞分为4组，spca1 DAC处理组、spca1对照组、beas2b DAC处理组、beas2b对照组，每组设置6个复孔，其中各处理组用10μM DAC处理4d。每天更换培养基和DAC。

NMPCR引物由文献中查得^[5]。p14ARF外部引物是5'-TGGGTTTTAGTTTGTAGTTAA-3'(正向)和5'-CTCCTCAATAACATCAACAC-3'(反向)。甲基化特异性p14ARF引物是5'-TTTTTGGTGTTAAAGGGTGGTGTAGT-3'(未甲基化正向)，5'-ACCACACACACACCAAATCCA-3'(未甲基化反向)，5'-GTGTTAAAGGGCGGCGTAGC-3'(甲基化正向)和5'-CGC-GACGAACCGCACGCGCG-3'(甲基化反向)。对于亚硫酸氢钠修饰后的基因组DNA进行三轮PCR，第一轮产物使用外部引物，产物包含目的基因，再将第一轮产物进行第二轮PCR，实验步骤按照实验说明进行。最后得到的产物采用2%琼脂糖凝胶进行电泳。

用细胞刮擦除去细胞，并加入含有1%苯基甲磺酰氟(PMSF)的放射免疫沉淀测定(RIPA)裂解缓冲液。然后，将生产物在冰上孵育30min，并离心以除去细胞碎片。通过蛋白质定量试剂盒测定蛋白质浓度。在12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上将50μg蛋白质以250mA转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。将膜在含有0.05%TBST和5%脱脂奶粉的TBS中在室温下封闭2h，然后加入1:500抗ARF抗体，1:1000 β-肌动蛋白抗体，在4℃保持过夜，用TBST洗涤。将膜孵育3次，然后与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗兔二抗在37℃下孵育1h。使用ECL检测目的蛋白质。通过Image J软件定量条带的密度测定，实验重复3次。

为了评估细胞凋亡，将4组细胞分别消化并调节密度为1×10⁶/ml，用冷PBS洗涤两次并加入1ml binding buffer以在离心后打浆，用Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)对细胞进行荧光染色，由FCM检测细胞凋亡，实验重复3次。

用SPSS进行统计学分析。实验数据以x±s表示。通过Student's t检验分析两个独立组之间的差异。检验水准为α= 0.05。

通过NMSP对spca1及beas2b细胞系进行p14基因启动子区甲基化状态进行检测，结果显示spca1细胞系p14基因启动子区呈甲基化状态，而beas2b此区域无甲基化。见图 1。

图 1

图 1 各组细胞p14基因启动子甲基化情况 注：Maker, 分子量标记物；M, p14启动子甲基化； U, p14启动子非甲基化

我们用DAC使细胞spca1及beas2b细胞中的p14基因启动子区去甲基化，通过Western blot检测ARF蛋白表达，结果显示DAC处理的spca1细胞恢复了ARF蛋白的表达，而beas2b细胞DAC处理组与beas2b对照组表达无明显差异。这些结果表明去除p14启动子区域甲基化，可以使该蛋白重新表达。见图 2。

图 2

图 2 各组p14ARF蛋白表达情况

应用10μm DAC处理细胞96h后，经流式细胞检测，结果显示spca1 DAC处理组细胞凋亡率(20.69±1.03)%显著高于spca1对照组(10.63±0.82)%，差异有统计学意义(t=13.17，P < 0.05);而beas2b DAC处理组细胞凋亡率(7.38±0.36)%与beas2b对照组(6.98±0.42)%无显著差异，差异无统计学意义(t=1.25，P>0.05)。该结果显示p14基因的去甲基化诱导spca1细胞的凋亡。见图 3。

图 3

图 3 各组细胞凋亡情况 注：①spca1对照组；②spca1 DAC处理组； ③beas2b对照组; ④beas2b DAC处理组

随着对表观遗传学的不断深入研究发现，DNA甲基化作为表观遗传学的一部分，对于细胞正常的功能及癌症的发生发展都起到很重要的作用^[6]。已有研究证明p14ARF在细胞中起到很多作用，p14作为抑癌基因主要通过中和E3泛素连接酶hMdm2对癌细胞的抑制作用来稳定和激活p53^[7]，也有证据表明它可以通过p53非依赖途径来起到促使细胞周期停滞或凋亡，从而起到抑癌的作用^[8-9]。导致p14基因的失活的因素有很多，本文主要针对p14基因启动子区域甲基化进行研究，验证其对p14表达的影响。

本文首先通过NMSPCR检测发现，肺癌肿瘤细胞系spca1中p14ARF启动子区域存在异常甲基化状态，而人正常支气管上皮细胞系beas2b此基因并未表现出异常甲基化，因此可以说明此区域甲基化对于肺癌的发展具有一定影响，这与它在肝癌、膀胱癌、肠癌等癌症中的发现结果一致^[10]。已经有研究证明，ARF的表达可以起到抑制癌症发生的作用^[11]。本文结果显示spca1细胞系无ARF蛋白表达而beas2b细胞系此蛋白正常表达，证明p14ARF启动子区域甲基化抑制其蛋白的表达。

有研究表明，DAC通过抑制DNA甲基转移酶Ⅰ从而起到去甲基化的作用，从而可以恢复基因的作用^[12]。因此，本文通过应用DAC处理spca1细胞系，使启动子异常甲基化的p14基因去除甲基化，恢复p14基因的表达。根据Western blot检测结果，验证了DAC可恢复ARF蛋白表达的猜测。现有的研究表明，细胞凋亡是调控细胞正常生长与增值的重要因素^[13]，而在癌细胞中细胞凋亡异常往往会导致癌细胞的异常增殖^[14]。进而我们针对ARF恢复表达后对细胞凋亡的影响进行了检测，通过流式细胞凋亡检测显示DAC处理后spca1细胞系凋亡增加，而对于正常的beas2b细胞系以上检测结果均无明显差异。由此我们分析，这种差异的原因可能是恢复表达后的p14基因通过两条抑癌途径^[15]，促进肺腺癌细胞凋亡，因此，可以得出p14ARF基因启动子区域异常甲基化可以抑制ARF蛋白的合成从而抑制肺癌细胞凋亡，使肺癌细胞异常增值。

综上所述，本文结果表明去除肺癌p14ARF启动异常甲基化对肺癌生物学功能存在影响，可以将其作为一种肺癌治疗靶点，或者影响其他抗癌药物的敏感性，为后续药物的研究提供一个研究方向。