2. 济宁医学院司法鉴定中心;
3. 济宁医学院, 济宁 272067
2. Judicial Authentication Center, Jining Medical University;
3. Jining Medical University, Jining 272067, China
甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤,近几年发病率呈高发态势[1]。乳头状癌是甲状腺癌最常见的病理类型,约占所有甲状腺癌病理类型的85%~90%。甲状腺癌患者中女性发病率明显高于男性,可能与雌激素水平有关[2]。虽然甲状腺乳头状癌(thyroid papillary carcinoma, PTC)分化好、恶性程度低、术后生存率较高,但仍有部分PTC患者术后易复发和转移[3]。PTC是一种受多基因、多因素影响的疾病。目前甲状腺癌相关标记物很多,其中BRAFV600E和端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase, TERT)启动子突变在PTC的发生、发展中发挥重要作用,可以作为监测PTC预后不良的分子指标[4]。本文着重从BRAFV600E和TERT启动子突变与PTC临床病理学特征的相关性进行综述。
1 BRAFV600E 1.1 BRAF基因分子结构及其功能RAF基因家族包括:ARAF、BRAF、CRAF。其中BRAF基因又称鼠类肉瘤滤过性同源体B1,位于人染色体7q34,基因大小约为190Kb。BRAF基因含有7个转录区,包含18个外显子,是激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)能力最强的激活物。该基因编码多种蛋白质,包括相对分子质量为94KDa、含783个氨基酸残基的BRAF蛋白。该蛋白属于丝/苏氨酸蛋白激酶,在RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK通路中发挥重要作用,是MEK/ERK最为关键的激活因子[5-6]。BRAF蛋白含有3个高度保守区:调节区结构域CR1、CR2和激酶结构域CR3。CR3含有丝氨酸和苏氨酸残基,他们的磷酸化也同样改变了BRAF激酶活性,从而在多种生物的生长发育过程中发挥着重要作用。
1.2 BRAFV600E基因突变活化通路Davies等[7]研究指出,在多种肿瘤中均存在BRAF基因突变,比如恶性黑色素瘤、结直肠癌、PTC等。BRAF基因突变位点大多集中在CR3激酶结构域的第11、15外显子上。第15外显子上T1799A点突变占BRAF基因全部突变形式的90%左右[8]。BRAF基因第15外显子的单个碱基的错义突变即第1799位的胸腺嘧啶被腺嘌呤替代,从而导致蛋白质产物中第600位的赖氨酸(V)被谷氨酸(E)替代(V600E),突变蛋白质BRAFV600E因构象改变而激活,向MAPK信号通路下游激酶(RAS-BRAF-MEK-ERK)传导信号,使MAPK信号通路持续激活,进而导致细胞异常增殖、分化,从而形成了肿瘤[9]。
1.3 BRAFV600E在PTC中的突变情况BRAFV600E在PTC中的突变率为31.3%~86.1%[10]。Zhang等[11]回顾性研究指出,BRAFV600E平均突变率为56.3%;Nasirden等[12]采用免疫组织化学染色技术检测BRAFV600E突变蛋白VE1在PTC组织中的表达,突变率为67.6%;Jin等[13]采用聚合酶链反应和基因测序等技术检测BRAFV600E基因突变,其突变率为63.7%。但Namba等[14]发现BRAFV600E基因突变在PTC细胞系中检出率明显高于相应的组织。因此,检测BRAF基因突变的可靠方法应为普通PCR后直接测序与免疫组化相结合,才能避免BRAF基因突变率差异,并且为患者预后和治疗提供更加可靠的理论依据。
1.4 BRAFV600E与PTC临床病理特征的关系BRAFV600E基因突变不仅在肿瘤的发生、发展中起着重要作用,而且与PTC不良临床病理特征密切相关,包括肿瘤组织大小、临床分期、局部复发、远处转移等,但这种关系目前尚存在争议。George等[15]研究证实BRAFV600E突变与PTC患者的临床病理特征无关。Nasirden等[12]收集了144位PTC患者石蜡组织切片,分别采用PCR和免疫组化技术同样得出一致的结论。但有研究证明BRAFV600E突变与多项PTC患者临床病理特征有关,如Xing等[4]收集了507例PTC患者样本表明BRAFV600E突变患者更容易发生腺外侵犯、颈部淋巴结转移、肿瘤组织分期晚。最近有报道指出[16],BRAFV600E基因突变仅与PTC患者年龄有关。Jin等[13]研究发现BRAFV600E突变与PTC患者年龄、甲状腺腺外侵犯、肿瘤组织大小及其分期显著相关。关于BRAFV600E突变与临床病理特征的关系目前报道很不一致,对于BRAFV600E突变与年龄、性别、肿瘤分期、肿瘤大小、局部复发、远处转移之间的关系需进一步研究。
2 TERT启动子突变 2.1 TERT的基因结构及编码蛋白端粒位于真核细胞线性染色体末端,是DNA与蛋白质的复合体,由简单的高度重复序列CCTTCCGGG组成。端粒会随着DNA的复制和细胞分裂逐渐缩短,最终导致细胞老化、凋亡。所以端粒在维持染色体的稳定性和DNA复制的完整性中发挥重要作用[17]。端粒酶是一种核糖核蛋白聚合酶,它以自身RNA上的一个片段为模板通过逆转录合成端粒的DNA重复序列,以延伸端粒, 避免细胞因端粒的缺失所导致的细胞老化、凋亡[18]。TERT是端粒酶的催化亚基,位于染色体5p15.33,其启动子区域为端粒酶表达最重要的调控区域,是决定端粒酶活性的关键因素。
2.2 TERT启动子突变活化通路TERT启动子区域有多种形式的突变,最常见的是1295 228 C > T和1295 250C > T(分别称为C228T和C250T)。这两个突变位点相互排斥[13, 19],都位于TERT启动子的核心区域,任何一个发生突变,都会使端粒酶的表达量增加,促进肿瘤的发生。分别位于ATG翻译起始位点上游-124bp和-146bp。这两种突变均可形成CCTCCCGGG序列,该序列为ETS/TCF转录因子的结合位点,可导致TERT基因表达上调,转录活性增强。
2.3 PTC中TERT启动子突变情况TERT启动子突变率在PTC中为7.5%~27%[13],TERT在PTC患者中的突变率仅为6%[12]。也有研究报道TERT启动子突变在PTC中的突变率高达46.7%[15]。针对TERT启动子在PTC中的突变情况的报道,尚无统一数据,可能与PTC患者的环境因素、饮食习惯、病例数的多少有关,需要进一步研究论证。
2.4 TERT启动子突变与PTC的临床预后大量研究进行论证分析一致表明,TERT启动子突变在具有较差临床病理指标PTC患者中发挥着重要作用。伴发TERT启动子突变的患者年龄偏大,肿瘤组织较大,分期晚,复发率和死亡率相对较高。Xing等[4]研究发现与无TERT突变者相比,TERT突变者远处转移的复发率和总复发率明显较高。不少研究指出,TERT启动子突变与患者的年龄、肿瘤组织的大小、肿瘤的分期有关,但与颈部淋巴结转移无关[16, 20]。Jin等[13]研究发现TERT启动子突变与患者的年龄、肿瘤组织大小、甲状腺腺外侵犯有关。而George等[15]发现TERT启动子突变仅与患者远处复发有关。由此可见TERT启动子突变与PTC患者临床病理特征的相关性仍需进一步确定。
3 BRAFV600E与TERT启动子联合突变与PTC的临床预后有实验证明同时包含BRAFV600E和TERT启动子突变的甲状腺肿瘤复发率显著提高,但患者生存率与TERT启动子突变相关,与BRAFV600E突变无关[15]。Xing和Liu等[4, 19]研究发现TERT启动子突变和BRAFV600E突变关系紧密,TERT启动子在BRAF突变型的患者中有着相对较高的突变率,当两者同时突变时,PTC患者临床病理特征最差。Moon等[21]也证实两种突变同时存在对PTC患者较差的临床病理特征产生协同作用,包括肿瘤组织大小、颈部淋巴结转移、甲状腺腺外侵犯。Vinagre等[22]报道同时具有TERT启动子和BRAFV600E突变的肿瘤中,TERT mRNA的表达水平最高,可能是BRAFV600E突变造成了MAPK通路异常激活,使细胞处于无限增值和分裂状态,细胞更容易出现端粒危机,更能触发TERT启动子突变,使端粒酶的活性增高,从而保持细胞的永生化。还有可能是BRAFV600E突变能增加ETS转录因子,这种转录因子刚好可以结合在TERT启动子突变产生的新位点上,增加了TERT的转录活性。但Landa等[23]结果显示在甲状腺乳头状癌中TERT启动子突变与BRAFV600E突变并不相关,此结论可能与纳入分析的病例数少有关。
4 小结与展望目前已有的研究显示同时出现TERT启动子及BRAFV600E突变可能与患者的不良预后相关,但其机制尚不明确,逐渐成为甲状腺乳头状癌的研究热点,并有希望成为分子诊断标志和预后指标。总之对TERT启动子突变和BRAFV600E基因突变进一步深入研究,有助于人们更好地理解肿瘤发生机制,而且为肿瘤的治疗提供了一个良好途径。
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