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  济宁医学院学报  2018, Vol. 41 Issue (4): 238-241  DOI:10.3969/j.issn.1000-9760.2018.04.003
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张磊, 刘志强, 徐祥文. 红花对兔心肌缺血-再灌注损伤的保护作用[J]. 济宁医学院学报, 2018, 41(4): 238-241. DOI: 10.3969/j.issn.1000-9760.2018.04.003.
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ZHANG Lei, LIU Zhiqiang, XU Xiangwen. Protective effects of Carthamus tinctorius on myocardial ischemia-reperfusion injury in rabbits[J]. Journal Of Jining Medical University, 2018, 41(4): 238-241. DOI: 10.3969/j.issn.1000-9760.2018.04.003.
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基金项目

2012年济宁市科技局项目

通信作者

刘志强, E-mail:liuzhiqiangjy@yeah.net;

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收稿日期：2018-01-19
Contents              Abstract              Full text              Figures/Tables              PDF
红花对兔心肌缺血-再灌注损伤的保护作用
张磊1, 刘志强2, 徐祥文3    
1. 日照市人民医院, 日照 276000;
2. 济宁医学院药学院;
3. 日照市120紧急救援指挥中心, 日照 276826
收稿日期：2018-01-19
基金项目：2012年济宁市科技局项目
通信作者：刘志强, E-mail:liuzhiqiangjy@yeah.net
摘要: 目的 探讨红花对兔心肌缺血-再灌注损伤的保护作用。方法 家兔随机分成3组：假手术组，缺血-再灌注损伤组，红花组，每组10只。ECG-1150心电图机观察心电图，检测血清乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸肌酶（CK）变化，免疫组化检测BCL-2蛋白表达，HE染色观察心肌细胞损伤情况并观察心肌梗死范围。结果 与假手术组相比，缺血-再灌注损伤组CK和LDH水平显著增加，差异有统计学意义（P < 0.05）；与假手术组相比，缺血-再灌注损伤组BCL-2蛋白阳性细胞数显著增多，差异有统计学意义（P < 0.05），缺血-再灌注损伤组心肌梗死范围增大，心肌细胞损伤显著；与缺血-再灌注损伤组CK和LDH水平相比，红花组CK和LDH水平显著降低差异有统计学意义（P < 0.05）；与缺血-再灌注损伤组BCL-2蛋白阳性细胞数相比，红花组BCL-2蛋白阳性细胞数显著减少，差异有统计学意义（P < 0.05），红花组心肌梗死范围减小，心肌细胞损伤减轻。结论 红花对兔心肌缺血-再灌注损伤有保护作用。
关键词: 红花    缺血-再灌注损伤    兔    
Protective effects of Carthamus tinctorius on myocardial ischemia-reperfusion injury in rabbits
ZHANG Lei1, LIU Zhiqiang2, XU Xiangwen3    
1. Rizhao People's Hospital, Rizhao, 276000, China;
2. College of Pharmacy, Jining Medical University;
3. 120 Emergency Rescue Command Center of Rizhao City, Rizhao 276826, China
Abstract: Objective To explore the protective effect of Carthamus tinctorius on myocardial ischemia-reperfusion injury in rabbits. Methods Rabbits were randomly divided into 3 groups (n=10):Sham operation group, Ischemia-reperfusion injury group, Carthamus tinctorius group.Ecg-1150 electrocardiogram machine was used to observe the electrocardiogram and lactate dehydrogenase(LDH), Creatine Kinase(CK) changes, immunohistochemical expression of BCL-2 protein, pathological sections HE staining were used to observe myocardial cells injuries and myocardial infarct size measurements. Results Compared with in the sham operation group, the levels of CK and LDH in the ischemia-reperfusion injury group increased significantly (P < 0.05).Compared with the sham operation group, ischemia-reperfusion injury group the BCL-2 protein positive cells count significantly increased (P < 0.05).The myocardial infarction in ischemia-reperfusion injury group had increased scope, and myocardial cells were injuried significantly.Compared with the ischemia-reperfusion injury group, the significant decreases occurred in CK and levels in the Carthamus tinctorius group were statistically significant (P < 0.05).In the ischemia-reperfusion injury group the BCL-2 protein positive cell number was reduced compared with carthamus tinctorius group.The difference was statistically significant (P < 0.05).Carthamus tinctorius group of myocardial infarction range decreased and the damage of myocardial cells were alleviated. Conclusion Carthamus tinctorius has protective effect on myocardial ischemia reperfusion injury in rabbits.
Key words: Carthamus tinctorius    Ischemia-reperfusion injury    Rabbit    

近年，经皮冠状动脉腔内成形术、冠脉搭桥术等缺血-再灌注治疗手段增多，心肌缺血-再灌注(ischemia-reperfusion，IR)损伤备受关注[1]。红花(Carthamus tinctorius L)可通过清除自由基、增强酶的活性、扩张血管等方面起到抗心肌缺血作用[2]。本实验通过结扎右冠状动脉建立心肌缺血动物模型，并从心肌酶检测、BCL-2蛋白表达、心肌梗死面积测量及病理切片镜像改变等方面研究红花对心肌缺血-再灌注损伤的保护作用。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试剂

氯化三苯四唑啉(上海化学试剂厂); BCL-2免疫试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司); 红花注射液(亚宝药业集团股份有限公司)。

1.1.2 仪器

心电图机(ECG-1150日本)；OLYMPUS显微镜(TOKYO日本)；LX20全自动生化分析仪(Beckman-Couher美国)；病理切片机(美国AO公司)。

1.1.3 实验动物及分组

健康兔30只，实验过程中死亡7只, 补7只, 共37只，体重2.0~2.5kg, 雌雄不拘，济宁医学院动物房提供，动物许可证号：SCXK(鲁)2014-0007，实验动物符合实验动物福利和动物伦理学的要求。

动物随机分为3组，每组10只，假手术组，在右冠状动脉下穿无创伤丝线，但不结扎；缺血-再灌注损伤组，缺血30min，再灌注120min；红花组为红花注射液在缺血前30min，2ml/kg耳缘静脉注射，缺血30min，再灌注120min。

1.2 方法 1.2.1 兔心肌缺血-再灌注模型建立

20%乌拉坦5ml/kg兔耳缘静脉缓慢注入，兔呼吸慢而平稳、肌张力下降且角膜反射消失即表示麻醉成功。随后将兔仰卧于手术台上将四肢和上颚固定，胸前剪毛。先沿胸骨中线右侧逐层剪开皮肤、皮下组织，可见肋骨，再沿肋骨右缘剪断3~5根肋骨，撑开胸腔，暴露心脏。观察到心脏跳动有力，右肺略有萎缩，用镊子轻夹起心包膜后剪开2cm左右的开口，牵拉右心耳，暴露右房室间沟。在距右房室间沟约5mm处右心室壁上可见右冠状动脉。将无创伤缝合线环绕右冠状动脉，将该缝合线从自制皮管内穿出置于体外，迅速缝合关胸。用针管从自制皮管中抽气，使右肺膨胀，抽紧环绕线造成右冠状动脉缺血，用止血钳夹住皮管，防止空气进入胸腔，观察呼吸是否平稳、心率是否正常。逐层将胸腔和表皮缝合，缺血30min，心电图机行心电监护，随后松开环绕线恢复心肌灌注120min。在心肌再灌注2h后从心脏取血，测定CK和LDH含量。取出心脏，在右心室前壁取1.2cm×1.5cm心肌，备用做病理切片，每组5个心脏冷藏后取出做心脏切片观察心肌梗死面积。红花组红花注射液在缺血前30min，2ml/kg耳缘静脉注射，假手术组、缺血-再灌注损伤组在缺血前30min注射等量生理盐水。

1.2.2 心电图观测

采用ECG-1150心电图机对各组兔做心电图。以针刺电极插于兔四肢皮下，全程监测标准肢体Ⅱ导联心电图。再灌注后ST值均有降低，降低的ST值称为ST回落值，即ΔST值(ΔST=结扎后30min ST值-复灌后ST值)。

1.2.3 心肌酶检测

再灌注2h后从心脏取血，用LX20全自动生化分析仪(美国)检测心肌酶含量，包括CK、LDH，速率法检测。

1.2.4 心肌梗死范围观测

1) 取材动物缺血-再灌注后取出心脏生理盐水冲洗后放置冰箱冷藏。2)心肌梗死范围观测取兔冷藏心脏，每组各取5只，去除心房，沿水平方向将心室肌切成约2~3mm的圆薄片，用滤纸将心肌薄片吸干，置于37℃的1%氯化三苯四唑啉磷酸缓冲液(pH=7.4)内，水浴15~30 min，确定梗死组织面积，观察梗死区域(灰白色)和正常心肌区域(红色)面积。

心肌损伤观测：1)取材动物缺血-再灌注后取心脏，在右心室前壁上取1.2cm×1.5cm的心肌。2)固定把取出的标本放入4%多聚甲醛缓冲液中6~8h。3)染色石蜡包埋HE染色。4)拍照用OLYMPUS光学显微镜观察，明美数码成像系统拍照。

1.2.5 检测BCL-2蛋白阳性细胞数

采用HP IAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统，于200倍光镜下选择血肿周围阳性细胞表达明显区域的3个相邻视野区，计数阳性细胞数，计算平均值。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 13.5分析实验数据。

2 结果 2.1 各组兔心电图变化

与假手术组相比，缺血-再灌注损伤组心电图ST段抬高，差异有统计学意义(P＜0.05)；与缺血-再灌注损伤组相比，红花组心电图ST段抬高降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表 1。

表 1 3组心电图ST段高度值比较(x±s)
2.2 各组兔心肌酶变化

与假手术组相比，缺血-再灌注损伤组CK和LDH水平增加, 差异有统计学意义(P＜0.05)；与缺血-再灌注损伤组相比，红花组CK和LDH水平显低, 差异有统计学意义(P＜0.05)。见表 2。

表 2 3组心肌酶检测数值比较(x±s，U/L)
2.3 各组兔心肌梗死范围检测结果

假手术组右心室无梗死发白，缺血-再灌注损伤组右心室梗死发白较明显，红花组与缺血-再灌注损伤组比较右心室梗死发白减轻。见图 1。

图 1 3组兔心肌梗死检测结果
2.4 各组兔病理切片检测结果

缺血-再灌注损伤组梗死区部分毛细血管扩张，细胞出现空泡，模糊不清晰，细胞核颜色变浅，细胞质出现肿胀，纤维排列不规则，红花组出现轻微的血管充血，较少出现细胞固缩、形态结构改变。见图 2。

图 2 3组兔心肌细胞形态
2.5 各组兔BCL-2蛋白表达情况

与假手术组相比，缺血-再灌注损伤组BCL-2蛋白阳性细胞数增多，与缺血-再灌注损伤组相比，红花组BCL-2蛋白阳性细胞数显著减少。见表 3、图 3。

表 3 3组心肌组织BCL-2蛋白阳性细胞数比较(x±s)
图 3 各组兔BCL-2蛋白表达情况(×200)
3 讨论

缺血-再灌注损伤可发生于溶栓、经皮穿刺冠状动脉腔内成形术、冠状动脉旁路移置术、各种冠状动脉再通术和心脏移植术后，严重威胁人类健康。国内外同行[3-5]对左冠状动脉缺血-再灌注损伤做了较多研究，而人及哺乳类动物90%以上的房室结动脉及2/3的窦房结动脉均起源于右冠状动脉，右冠状动脉位置深，变异较大，从而对右冠状动脉的研究增加了难度。本文观察了红花注射液[6-7]对在体兔右心缺血-再灌注损伤的影响，通过红花预处理后结扎右冠状动脉缺血30min，再灌注120min后心肌损伤减轻，其对右心缺血-再灌注损伤的保护，在国内外未见报道。

本文缺血-再灌注损伤组与假手术组比较，心电图抬高显著，CK、LDH明显升高，右心室心肌梗死明显，病理切片HE染色细胞损伤严重, BCL-2蛋白表达升高，说明结扎右冠状动脉造成右心缺血-再灌注损伤明显；红花组与缺血-再灌注损伤组比较，红花组的各项指标均降低，说明红花减轻了缺血-再灌注的损伤。

当发生心肌梗死时心肌氧摄取率降低，对自由基清除能力下降，心肌细胞内氧自由基爆发式增长[8]，通过系列病理生理作用，引发心肌缺血-再灌注损伤。红花通过抑制氧自由基生成、增强心肌酶活性、改善微循环等作用减轻缺血-再灌注过程中心肌细胞的损伤[9]，对兔心肌缺血-再灌注损伤起到保护作用，临床上在应用红花预防心缺血-再灌注损伤具有广阔前景，对临床治疗具有指导意义。

参考文献
[1] Jiang G, Liu X, Wang M, et al. Oxymatrine ameliorates renal ischemia-reperfusion injury from oxidative stress through Nrf2/HO-1 pathway[J]. Acta Cir Bras, 2015, 30(6): 422–429. DOI:10.1590/S0102-865020150060000008
[2] Hu T, Wei G, Xi M, et al. Synergistic cardioprotective effects of Danshensu and hydroxysafflor yellow A against myocardial ischemia-reperfusion injury are mediated through the Akt/Nrf2/HO-1 pathway[J]. Int J Mol Med, 2016, 38(1): 83–94. DOI:10.3892/ijmm.2016.2584
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[4] Hu SY, Zhang Y, Zhu PJ, et al. Liraglutide directly protects cardiomyocytes against reperfusion injury possibly via modulation of intracellular calcium homeostasis[J]. J Geriatr Cardiol, 2017, 14(1): 57–66. DOI:10.11909/j.issn.1671-5411.2017.01.008
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[8] Jeremic N, Petkovic A, Srejovic I, et al. Effects of ischemia and omeprazole preconditioning on functionalrecovery of isolated rat heart[J]. 2015, 30(2): 266-275. DOI: 10.5935/1678-9741.20150020. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26107460
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