2. 济宁市食品药品检验检测中心, 济宁 272000
2. Jining City Food and Drug Inspection Testing Center, Jining 272000, China
蒲公英为常用的药食两用中药材，其嫩苗是人们喜爱的野菜，含有多种维生素和人体所必需的常量和微量元素[1-2]，具有很高的食用价值，食用历史悠久，早在《唐本草》中就有记载[3]。蒲公英含有黄酮类、萜类等化学成分[4-5]，具有免疫调节等作用[6]。本文探讨了不同采收期蒲公英根、叶、花中总黄酮含量变化规律，并观测其对小鼠体液免疫功能的影响，为其合理采收利用及药效学应用提供科学依据。
1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 原料及试剂蒲公英药材采集于山东日照，经济宁医学院药学院王建安副教授鉴定，采集时间3月25日至6月25日，期间每月10日、25日采摘，采集总量为500g，50℃烘干后备用。样品保存于济宁医学院药学院中药标本室。槲皮素对照品(南昌贝塔生物科技有限公司)。HPD-400型大孔树脂购自上海劲凯树脂有限公司。Drabkin试剂(D5941-6VL，Sigma公司)。
1.1.2 实验动物清洁级KM小鼠，(20±2)g，雌雄兼用；新西兰家兔，(2±0.2)kg；豚鼠，(200±20)g。以上动物均采购于山西医科大学动物中心(生产许可编号2009-0001)，动物实验符合实验福利和动物伦理学的要求。
1.1.3 仪器紫外可见分光光度计(UV754N，上海精科实业有限公司)；离心机(LD5-2A，北京雷勃尔离心机有限公司)；超声波提取机(昆山市超声仪器有限公司)。
1.2 总黄酮含量测定 1.2.1 供试品溶液的制备将采集于不同时期的蒲公英根、叶、花药材，50℃干燥，粉碎过40目筛，分别称量药材粉末100g，加入65%乙醇50ml浸泡30min后，在60℃、80KHz的频率下超声提取3次，每次20min，冷却后抽滤合并提取液，旋转蒸发回收溶剂得提取浸膏，按照文献[7]进行纯化，回收洗脱液得浸膏，再用甲醇将浸膏溶解，将其转移至100ml容量瓶中，加甲醇定容，摇匀得待测液。
1.2.2 对照品溶液的配制用万分之一分析天平称取槲皮素对照品0.0100g，用甲醇溶解后转移至100ml容量瓶，甲醇定容，得槲皮素对照品溶液，浓度为0.1 mg/ml。
1.2.3 检测波长的选择取蒲公英供试品溶液和槲皮素对照品溶液，按照文献[7]的方法显色，于200~700 nm的波长范围内进行全程扫描，扫描结果两者在388 nm波长处均出现最大吸收，且干扰小，故选择检测波长为388 nm。
1.2.4 标准曲线的建立用移液管准确量取1.2.2项下的槲皮素对照品溶液0、1、2、3、4、5、6ml，分别转移到25ml容量瓶中，按照文献[8]的方法显色，用甲醇定容，在388 nm波长处测定其吸光度。以浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，得回归方程为Y=25.518X－0.0076，r=0.9995。
1.2.5 总黄酮含量测定精密量取不同编号的供试品溶液1ml，转移至25ml容量瓶中，按照1.2.4项下方法配制溶液，于388 nm波长处测定其吸光度，根据回归方程计算得出各药材总黄酮含量。
1.3 小鼠体液免疫功能的测定 1.3.1 蒲公英供试液的制备分别称取4月10日采集的蒲公英花、叶、根药材粉末5g，按照1.2.1项下方法得总黄酮浸膏，在100ml容量瓶中用蒸馏水定容，配得浓度为0.05g/ml的蒲公英供试液。
1.3.2 兔血红细胞悬液的制备家兔耳缘静脉取血20ml，离心2000r/min，5min，弃上清液；加与沉淀等量的生理盐水，离心1500r/min，5min，清洗2次，弃上清液；离心2000r/min，10min，弃上清液，得兔血红细胞，用生理盐水1:5稀释，得兔血红细胞悬液，测定小鼠体液免疫功能时用作抗原。
1.3.3 豚鼠血清溶液的制备取豚鼠心脏血10ml，离心2000r/min，10min，取上清，用生理盐水1:10(V:V)稀释，置于4 ℃冰箱中备用，测定小鼠体液免疫功能时用作补体。
1.3.4 溶血素测定法测定小鼠体液免疫功能[9]50只KM小鼠随机分为空白组(生理盐水)、阳性对照组(黄芪精口服液)、蒲公英根、叶、花供试液组，共5组，每组10只，分别灌胃给药0.5ml，给药后0.5h，每鼠腹腔注射0.2ml兔血红细胞悬液，免疫小鼠常规喂养6d，眼球取血，处理样品[10]，离心2000r/min，10min，取上层血清，用生理盐水稀释500倍。取1ml已稀释好的血清置于试管中，加入兔血红细胞悬液0.5ml，将试管置于冰浴中冷却，向试管中加入补体1ml，再将其移至37℃恒温水浴中，保温10min，随即放置于冰浴中。2000r/min，10min，取上清液，测其吸收度。经兔红细胞免疫后的小鼠，可产生兔红细胞抗体即溶血素，血清溶血素含量以半数溶血值(HC50)表示。计算公式如下式即抗体含量。
| $ {\rm{H}}{{\rm{C}}_{50}}{\rm{ = }}\frac{{样品吸收度值}}{{免红细胞溶液半数溶血时的吸收度值}} \times 稀释倍数 $ | (1) |
采用SPSS19.0软件进行统计学分析。
2 结果 2.1 蒲公英中总黄酮含量4月10日各器官中总黄酮的含量比其它时期含量高，花中总黄酮含量最高。见表 1。
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表 1 蒲公英中总黄酮含量(%) |
蒲公英根、叶、花总黄酮均有增强小鼠体液免疫功能的作用，其中花作用最强，与黄芪精口服液组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。见表 2。
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表 2 蒲公英根、叶、花总黄酮对小鼠半数溶血值(HC50)的影响(x±s) |
本文结果显示，同一时期蒲公英不同部位的总黄酮含量有明显差异，其高低顺序为花＞叶＞根，与蒲公英的传统药用部位为地上部分相一致。中药质量取决于其中有效物质的含量，而有效物质的含量高低与采收期有密切关系。蒲公英是人们喜爱的绿色保健中草药，为使其发挥更大的保健作用，笔者测定了不同时期蒲公英总黄酮含量，结果表明，3~6月份蒲公英花、叶、根中总黄酮含量变化遵循逐渐升高达到峰值又逐渐降低的动态变化规律，4月10日各器官中总黄酮的含量达到最高值，其中花含量最高，该结果为蒲公英的合理采收提供了科学依据。
本文以HC50观测蒲公英根、叶、花对小鼠体液免疫功能的影响。笔者选取总黄酮含量最高的4月10日蒲公英花、叶、根，研究了其对小鼠体液免疫功能的影响，结果表明均有增强小鼠体液免疫的作用，其中花作用最强，该结果为蒲公英药效物质基础的研究提供了参考。综上所述，蒲公英花中总黄酮含量最高，而且增强小鼠体液免疫的作用最强，有必要对其展开深入研究，如开发蒲公英花茶等保健品。
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