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  济宁医学院学报  2018, Vol. 41 Issue (4): 229-234  DOI:10.3969/j.issn.1000-9760.2018.04.001
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吴鹏, 王亚东, 李茂涛, 蒋怀周. Jagged/Notch信号通路在铜负荷大鼠肝纤维化发生过程中的作用[J]. 济宁医学院学报, 2018, 41(4): 229-234. DOI: 10.3969/j.issn.1000-9760.2018.04.001.
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WU Peng, WANG Yadong, LI Maotao, JIANG Huaizhou. Jagged/Notch signaling pathway contributes to the progress of hepatic fibrosis induced by copper overload in rats[J]. Journal Of Jining Medical University, 2018, 41(4): 229-234. DOI: 10.3969/j.issn.1000-9760.2018.04.001.
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基金项目

国家自然科学基金青年基金资助(81202691);安徽省高校自然科学研究重点项目(KJ2016A409);安徽中医药大学自然科学研究重点项目(2017zrzd003)

文章历史

收稿日期:2018-05-30
Jagged/Notch信号通路在铜负荷大鼠肝纤维化发生过程中的作用
吴鹏1, 王亚东1, 李茂涛2, 蒋怀周3    
1. 安徽中医药大学中西结合学院, 合肥 230012;
2. 安徽中医药大学针灸推拿学院, 合肥 230012;
3. 安徽中医药大学中医学院, 合肥 230012
摘要: 目的 探讨Jagged/Notch信号通路在铜负荷大鼠肝纤维化发生发展中的作用。方法 雄性SD大鼠36只随机分为对照组、模型组,模型组按造模后不同时间分为8、12、16、20、24周5个亚组,每组6只。模型组喂饲含1.5g/kg硫酸铜的粉状饲料和0.185%硫酸铜去离子水,观察大鼠一般情况,全自动生化分析仪测定各组大鼠肝组织血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、血清天冬氨酸氨基转移酶(AST)、透明质酸(HA)、层粘蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)水平;比色法测定大鼠肝脏羟脯氨酸(Hyp)水平;HE、Masson染色法观察大鼠肝脏病理学改变;实时荧光定量PCR法检测TGF-β1、Notch1、Notch3、Hes1、Hes5 mRNA表达情况;Western blot检测Jagged1、Notch3、Hes1蛋白表达情况,免疫组化方法检测Hes1、a-SMA表达情况。结果 与正常组相比,模型组大鼠肝组织ALT、AST、HA水平自造模第8周开始升高,PCⅢ、LN、Hyp水平自第12周开始升高,差异有统计学意义(P < 0.05),肝组织炎症及纤维化程度进行性加重,TGF-β1、Notch3、Hes1 mRNA及Jagged1、Notch3、Hes1蛋白表达显著升高,差异有统计学意义(P < 0.05);Hes1蛋白在模型组纤维化区域大量表达,与肌成纤维细胞标志蛋白a-SMA表达区域高度重合,两者表达量呈同步增加关系(r=0.952,P < 0.05)。结论 Jagged1/Notch3/Hes1信号通路可能参与铜负荷大鼠肝纤维化的发生与发展,并与肝纤维化的严重程度密切相关。
关键词: Jagged/Notch信号通路    铜负荷大鼠    肝纤维化    动态表达    
Jagged/Notch signaling pathway contributes to the progress of hepatic fibrosis induced by copper overload in rats
WU Peng1, WANG Yadong1, LI Maotao2, JIANG Huaizhou3    
1. College of integrated traditional Chinese and Western Medicine of AHTCM, Hefei 230012, China;
2. College of acupuncture and massage of AHTCM, Hefei 230012, China;
3. College of traditional Chinese medicine of AHTCM, Hefei 230012, China
Abstract: Objective To investigate the role of Jagged/Notch signaling pathway contributing to the progress of hepatic fibrosis induced by copper overload in rats. Methods Thirty-six male Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal group(n=6) and model group(n=36).The model group was further divided into five subgroups of 8 weeks, 12 weeks, 16 weeks, 20 weeks, and 24 weeks with six rats in each subgroup, according to different time after modeling.The model group was fed with powdered diet containing 1.5g/kg of copper sulfate and deionized water containing 0.185% copper sulfate.General condition of the rats was observed.Serum levels of alanine aminotransferase(ALT), serum aspartate aminotransferase (AST), hyaluronic acid (HA), laminin (LN), type of Ⅲ procollagen(PC), and hydroxyproline content in liver tissues were tested dynamically according to different time points mentioned above.Liver pathological changes were observed with HE and Masson staining.Expressions of TGF-changes were observed ere tes and Jagged1/Notch3/Hes1 proteins were detected dynamically with RT-PCR and Western Blot.Immunohistochemistry was used to detect expressions of Hes1 and a-SMA. Results The serum levels of ALT, AST, HA and PCⅢ, LN, Hyp after 8 and 12 weeks of modeling were significantly higher than those in control group(P < 0.05).The degree of inflammation and fibrosis increased progressively.The expressions of TGF-β1, Notch3, Hes1 mRNA and Jagged1, Notch3, Hes1 protein increased(P < 0.05).The Hes1 protein was expressed in a large amount in the fibrotic region, which coincided greatly with the a-SMA (myofibroblast marker protein) expression, and the two proteins increased synchronously(r=0.952, P < 0.05). Conclusion Jagged1/Notch3/Hes1 signaling pathway is possibly involved in the occurrence and development of liver fibrosis in rats with copper overload, and is closely related to the severity of liver fibrosis.
Key words: Jagged/notch signaling pathway    Copper overloaded rat    Liver fibrosis    

肝豆状核变性(hepatolenticular degeneration,HLD)是一种铜代谢障碍性疾病。铜作为氧化物前体促进氧自由基和有害的脂质过氧化产物形成,刺激肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化增殖,转化为肌成纤维细胞,导致肝损伤修复时细胞外基质(extra cellular matrix,ECM)的合成与降解不平衡,表现为较早出现中晚期肝纤维化,且病理学改变较临床症状严重[1-3]

Jagged/Notch信号通路是相邻细胞之间通讯进而调控细胞发育的重要通路,在决定细胞命运、影响器官形成和形态发生过程中作用重大[4-5]。目前发现Jagged/Notch信号通路在多种致肝纤维化疾病中被激活[6-7],但是对于HLD引起的肝纤维化,尚未清楚。本文通过构建铜负荷大鼠肝纤维化模型,探讨Jagged/Notch信号通路相关基因在大鼠肝组织的动态表达及意义,为更好认识HLD肝纤维化发病机制提供基础实验数据。

1 材料 1.1 动物

雄性清洁级SD大鼠36只,安徽医科大学实验动物中心提供,12~13周龄,(200±20)g,生产许可证号:SCXK(皖)2013-01,动物实验符合实验动物福利和动物伦理学要求。

1.2 仪器及试剂

OLYMPUS全自动生化仪(OLYMPUS公司);FJ-2003γ放射免疫计数器(华粤企业集团);石蜡切片机(Leica公司);荧光定量PCR仪(ABI公司);全波长酶标仪(Thermo Fisher公司);化学发光检测系统(Clinx Science Instruments公司);图像采集系统(Leica公司)。ALT、AST、HA、LN、PCⅢ、Hyp试剂盒(建成生物工程研究所);Masson试剂盒(索莱宝科技有限公司);实时荧光定量PCR试剂(Thermo Fish公司);一抗Jagged1、Notch3、Hes1、a-SMA抗体(Abcam公司);二抗山羊抗小鼠、山羊抗兔抗体(康为世纪生物科技有限公司);即用型SABC试剂盒(博士德公司)。

2 方法 2.1 分组及造模

36只SD大鼠随机分为正常组(6只)和模型组(30只),正常组普通饲料喂养,模型组喂饲含1.5g/kg硫酸铜的粉状饲料和0.185%硫酸铜去离子水建立铜负荷大鼠模型[8-9],按造模后不同时间分为8、12、16、20、24周5个亚组,每组6只。各组动物分别于以上观察时间点结束时,观察大鼠饮食饮水、活动度及精神状况,称体质量,10%水合氯醛0.4ml/kg腹腔麻醉,心脏采血,3000r/min离心10min收集血清;取肝脏称质量,部分组织4%中性甲醛固定,行病理及免疫组化检测,余组织迅速液氮冻存后,-80℃冰箱保存待测。

2.2 指标测定 2.2.1 一般情况观察

观察各组大鼠生存状态、肝脏形态,计算肝脏指数。

2.2.2 血清学指标测定

采用全自动生化分析仪,按照试剂盒说明书检测各组大鼠肝功能ALT、AST含量;放免法检测血清肝纤维化指标HA、LN、PCⅢ含量。

2.2.3 Hyp含量测定

采用比色法,按照试剂盒说明书规范操作,测定各组大鼠肝组织Hyp水平。

2.2.4 病理学检查

取各组大鼠肝叶,4%中性甲醛固定。HE染色及Masson染色,光镜下观察各组大鼠肝组织炎症及纤维化程度。

2.2.5 实时荧光定量PCR

提取各组大鼠肝组织RNA后,由上海生工生物工程有限公司设计并合成引物(表 1),依据以下步骤测定各基因mRNA的表达。1)cDNA合成:反应体系为总RNA 8μl、10μM Oligo(dT)1μl、5×M-MLV Buffer 4.0μl、10mM dNTP 2.0μl、RNasin 1.0μl等,42℃ 60min→70℃ 5min,反应液即为cDNA。2)SYBR Green Real-time PCR:反应体系为cDNA2.0μl、2×SYBR Green mixture10μl、引物0.4μl、2×ROXⅡ0.4μl等,扩增40个循环后(95℃, 5s;60℃, 34s),95℃, 15s→60℃, 60s→95℃, 15s。用RQ值(2-ΔΔCt)表示待测基因mRNA的相对表达量。

表 1 引物序列
2.2.6 Western blot检测

肝组织加入蛋白裂解液后取上清,使用BCA法进行总蛋白定量,10%SDS-PAGE电泳,将分离的蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上,5%脱脂奶粉-TBST缓冲液进行膜封闭处理,一抗4℃孵育过夜(beta-actin 1 :1000,Jagged1 1 :300,Notch3 1 :400,Hes1 1 :400),TBST洗脱3次,加入相应的二抗(山羊抗小鼠1 :10000,山羊抗兔1 :5000),孵育1h,TBST浸泡PVDF膜,摇床上洗膜后,ECL发光试剂盒检测目的蛋白。采用Quantity one灰度分析软件分析,计算目的蛋白灰度值/β-actin灰度值即为目的蛋白相对表达量。

2.2.7 免疫组织化学染色

采用链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)法,经脱蜡,高压修复后,封闭液孵育25min,滴加一抗(a-SMA和Hes1均为1 :200稀释),PBS冲洗后滴加生物素标记的二抗(1 :100)及链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物,DAB显色。阳性标本上用PBS代替一抗作阴性对照。Image Pro Plus 6.0图像分析系统测量肝组织平均积分吸光度(A)值[积分吸光/组织面积],用以代表阳性部位蛋白表达水平。

2.3 统计学方法

采用SPSS16.0统计软件对数据进行分析,计量资料采用x±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD检验,相关分析采用Pearson相关,以P<0.05为有统计学意义。

3 结果 3.1 一般情况观察

正常组大鼠毛发光泽,活跃好动,行动敏捷,食欲良好,体重持续增加。模型组大鼠随着时间延长,逐渐出现精神萎靡,毛发光泽度变差,运动缓慢,食欲减退等现象,从造模第16周开始出现体重不增加或增加缓慢,甚至负增长。肉眼观察正常组大鼠肝脏呈红褐色,光滑柔软,无颗粒物;模型组大鼠肝脏颜色暗红,质韧,边缘变钝,第20周及24周大鼠肝脏表面可见粗糙不平,呈沙粒状的颗粒物。与正常组相比,模型组从第16周开始肝脏指数增大,差异有统计学意义(P<0.05)。见表 2

表 2 各组大鼠肝脏指数、肝功能及肝纤维化指标(x±s,n=6)
3.2 大鼠血清学指标水平变化

模型组大鼠ALT、AST、HA水平自造模第8周开始升高,PCⅢ、LN自第12周开始升高,与正常组相比差异有统计学意义(P<0.05)。见表 2

3.3 各组大鼠肝组织Hyp水平变化

模型组大鼠自造模第12周起Hyp含量升高,与正常组相比差异有统计学意义(P<0.05)。见图 1

图 1 各组大鼠肝组织Hyp含量 注:与正常组比较,*P<0.05
3.4 大鼠肝组织病理组织学结果

HE染色及Masson染色结果显示,正常组肝小叶结构完整清晰,细胞条索排列规整。模型组随着铜负荷时间延长,肝组织炎性反应、变性坏死、纤维组织增生呈进行性加重。造模第8周表现为肝细胞肿胀、脂肪变性、少量点灶状坏死、炎细胞浸润;第12周表现为脂肪变性、坏死加重, 可见炎细胞浸润、纤维组织开始增生;第16周表现为肝小叶结构紊乱,弥漫性脂肪变性,炎细胞浸润加重, 可见轻中度碎片样坏死,纤维条索形成。第20周表现为碎片状坏死伴少量桥接坏死,可见大量纤维条索及部分纤维间隔形成。第24周表现为碎片状坏死及桥接坏死加重,大量纤维间隔形成,可见部分假小叶。见图 23

图 2 各组大鼠肝组织病理组织学结果(H-E染色, ×200)
图 3 各组大鼠肝组织病理组织学结果(Masson染色, ×200)
3.5 大鼠TGF-β1、Notch1、Notch3、Hes1、Hes5 mRNA表达情况

模型组自第12周开始Tgf-β1、Notch3、Hes1 mRNA表达升高,与正常组相比差异有统计学意义(P<0.05)。相关分析结果显示Notch3、Hes1mRNA与Tgf-β1mRNA表达水平呈正相关。见表 3

表 3 各组大鼠肝组织Tgf-β1、Notch1、Notch3、Hes1、Hes5 mRNA表达(x±s,n=6)
3.6 大鼠肝组织Jagged1、Notch3、Hes1蛋白表达情况

蛋白印迹结果显示,模型组大鼠随着铜负荷时间延长,肝组织Jagged1、Notch3、Hes1蛋白表达量逐渐增加, 至24周假小叶形成达到高峰。Jagged1自造模第12周、Notch3自造模第16周、Hes1自造模第8周开始蛋白表达量增加,与正常组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图 4

图 4 各组大鼠肝组织Jagged1、Notch3、Hes1蛋白表达情况(x±s,n=6) 注:1,正常组;2,造模第8周;3,造模第12周;4,造模第16周;5,造模第20周;6,造模第24周与正常组比较, *P<0.05
3.7 各组大鼠肝组织Hes1、α-SMA蛋白表达情况

正常组Hes1蛋白较少表达于胆管上皮细胞及肝细胞,细胞膜及细胞质呈棕黄色染色,细胞核不着色;模型组随着造模时间延长,Hes1蛋白表达逐渐增加,在假小叶形成的第24周达到高峰,主要集中于肝纤维化区域,汇管区和靠近肝纤维化区域的肝细胞、胆管上皮细胞及炎性细胞亦有表达。肌成纤维细胞标志蛋白α-SMA在正常组大鼠的肝组织未见明显表达;模型组从第16周纤维条索形成开始表达显著增加,第24周达到顶点,集中于汇管区的纤维间隔或纤维条索。Hes1与α-SMA表达区域大部分重合于纤维化区域。见图 5图 6

图 5 免疫组织化学法检测各组大鼠肝组织Hes1蛋白表达情况(SABC法,×400) 注:长箭头:肌成纤维细胞
图 6 免疫组织化学法检测各组大鼠肝组织α-SMA蛋白表达情况(SABC法,×400) 注:短箭头:肌成纤维细胞

蛋白平均吸光度(A)值结果显示,与正常组相比,模型组大鼠肝组织Hes1、α-SMA蛋白表达逐渐增加,纤维条索开始形成的第16周以后增加,到假小叶形成的第24周两者均达到高峰。相关分析显示Hes1与α-SMA蛋白表达量呈同步正相关(r=0.952,P<0.05)。见表 4

表 4 各组大鼠肝组织Hes1、α-SMA蛋白平均吸光度(A)值比较(x±s,n=6,×10-2)
4 讨论

Jagged/Notch信号通路进化上高度保守,通过相邻细胞之间的相互作用决定细胞分化、凋亡、增殖。国内外对Jagged/Notch信号通路与疾病研究以往主要集中在肿瘤、遗传性疾病等,近期发现该通路与肝纤维化的发生发展密切相关[10]。在新鲜分离的原代HSC细胞中可检测到Notch配体(Jagged1)及受体(Notch1、2、4)的基因表达,致肝纤维化关键因子TGF-β1刺激活化HSC细胞转化为肌成纤维细胞后,Notch1、Notch3 mRNA及蛋白表达呈上升趋势,a-SMA和Ⅰ型胶原表达增加[11-12]。在四氯化碳诱发肝纤维化模型,配体Jagged1,受体Notch2、Notch3和下游分子Hes1的mRNA表达增加,Notch信号活化形式NICD和Hes1在损伤的汇管区大量表达,应用Notch3特异性的siRNA抑制Notch3的表达可使肌成纤维细胞分泌功能明显降低[13]。目前对于HLD铜沉积引起的肝纤维化,尚无Jagged/Notch信号通路的相关研究。

肝脏是HLD铜蓄积主要靶器官,铜作为一种强氧化剂,长期过载可引起弥漫性肝细胞脂肪变性、活动性肝炎,刺激肝星状细胞活化为肌成纤维细胞,后者大量分泌胶原纤维、层黏蛋白等细胞外基质(ECM),导致肝损伤修复时ECM合成与降解不平衡,引起肝纤维化。

本文采用含1.5g/kg硫酸铜的粉状饲料和0.185%硫酸铜去离子水喂饲大鼠,发现随着铜在肝脏的蓄积,血清肝功能及肝纤维化指标、肝组织Hyp含量均呈动态增高趋势,病理学检查展现了从弥漫性脂肪变性、活动性肝炎到肝纤维化形成的完整过程,为研究HLD肝纤维化提供了一个参考模型。在此过程中,Jagged1/Notch3/Hes1信号通路持续被激活,下游靶基因Hes1在纤维化区域大量表达,与肌成纤维细胞标志蛋白a-SMA表达区域大部分重合,并随着肝纤维化的进行性加重而同步表达增加。由此我们认为铜沉积可以激活Jagged1/Notch3/Hes1信号通路,介导肝星状细胞转化为肌成纤维细胞并促其活化增殖,促使了肝纤维化的发生与发展。

通过本文结果,我们推断Jagged/Notch信号通路可能与HLD肝纤维化密切相关,开展相关研究,可以更好地认识HLD肝纤维化的发病机制,为寻找抗HLD肝纤维化的可能作用靶点提供重要线索。目前,铜沉积通过相邻细胞之间Jagged1/Notch3/Hes1信号通路,刺激肌成纤维细胞活化增殖的作用机制尚未清楚,我们将进一步深入研究。

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