2. 安徽中医药大学针灸推拿学院, 合肥 230012;
3. 安徽中医药大学中医学院, 合肥 230012
2. College of acupuncture and massage of AHTCM, Hefei 230012, China;
3. College of traditional Chinese medicine of AHTCM, Hefei 230012, China
肝豆状核变性(hepatolenticular degeneration,HLD)是一种铜代谢障碍性疾病。铜作为氧化物前体促进氧自由基和有害的脂质过氧化产物形成,刺激肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化增殖,转化为肌成纤维细胞,导致肝损伤修复时细胞外基质(extra cellular matrix,ECM)的合成与降解不平衡,表现为较早出现中晚期肝纤维化,且病理学改变较临床症状严重[1-3]。
Jagged/Notch信号通路是相邻细胞之间通讯进而调控细胞发育的重要通路,在决定细胞命运、影响器官形成和形态发生过程中作用重大[4-5]。目前发现Jagged/Notch信号通路在多种致肝纤维化疾病中被激活[6-7],但是对于HLD引起的肝纤维化,尚未清楚。本文通过构建铜负荷大鼠肝纤维化模型,探讨Jagged/Notch信号通路相关基因在大鼠肝组织的动态表达及意义,为更好认识HLD肝纤维化发病机制提供基础实验数据。
1 材料 1.1 动物雄性清洁级SD大鼠36只,安徽医科大学实验动物中心提供,12~13周龄,(200±20)g,生产许可证号:SCXK(皖)2013-01,动物实验符合实验动物福利和动物伦理学要求。
1.2 仪器及试剂OLYMPUS全自动生化仪(OLYMPUS公司);FJ-2003γ放射免疫计数器(华粤企业集团);石蜡切片机(Leica公司);荧光定量PCR仪(ABI公司);全波长酶标仪(Thermo Fisher公司);化学发光检测系统(Clinx Science Instruments公司);图像采集系统(Leica公司)。ALT、AST、HA、LN、PCⅢ、Hyp试剂盒(建成生物工程研究所);Masson试剂盒(索莱宝科技有限公司);实时荧光定量PCR试剂(Thermo Fish公司);一抗Jagged1、Notch3、Hes1、a-SMA抗体(Abcam公司);二抗山羊抗小鼠、山羊抗兔抗体(康为世纪生物科技有限公司);即用型SABC试剂盒(博士德公司)。
2 方法 2.1 分组及造模36只SD大鼠随机分为正常组(6只)和模型组(30只),正常组普通饲料喂养,模型组喂饲含1.5g/kg硫酸铜的粉状饲料和0.185%硫酸铜去离子水建立铜负荷大鼠模型[8-9],按造模后不同时间分为8、12、16、20、24周5个亚组,每组6只。各组动物分别于以上观察时间点结束时,观察大鼠饮食饮水、活动度及精神状况,称体质量,10%水合氯醛0.4ml/kg腹腔麻醉,心脏采血,3000r/min离心10min收集血清;取肝脏称质量,部分组织4%中性甲醛固定,行病理及免疫组化检测,余组织迅速液氮冻存后,-80℃冰箱保存待测。
2.2 指标测定 2.2.1 一般情况观察观察各组大鼠生存状态、肝脏形态,计算肝脏指数。
2.2.2 血清学指标测定采用全自动生化分析仪,按照试剂盒说明书检测各组大鼠肝功能ALT、AST含量;放免法检测血清肝纤维化指标HA、LN、PCⅢ含量。
2.2.3 Hyp含量测定采用比色法,按照试剂盒说明书规范操作,测定各组大鼠肝组织Hyp水平。
2.2.4 病理学检查取各组大鼠肝叶,4%中性甲醛固定。HE染色及Masson染色,光镜下观察各组大鼠肝组织炎症及纤维化程度。
2.2.5 实时荧光定量PCR提取各组大鼠肝组织RNA后,由上海生工生物工程有限公司设计并合成引物(表 1),依据以下步骤测定各基因mRNA的表达。1)cDNA合成:反应体系为总RNA 8μl、10μM Oligo(dT)1μl、5×M-MLV Buffer 4.0μl、10mM dNTP 2.0μl、RNasin 1.0μl等,42℃ 60min→70℃ 5min,反应液即为cDNA。2)SYBR Green Real-time PCR:反应体系为cDNA2.0μl、2×SYBR Green mixture10μl、引物0.4μl、2×ROXⅡ0.4μl等,扩增40个循环后(95℃, 5s;60℃, 34s),95℃, 15s→60℃, 60s→95℃, 15s。用RQ值(2-ΔΔCt)表示待测基因mRNA的相对表达量。
肝组织加入蛋白裂解液后取上清,使用BCA法进行总蛋白定量,10%SDS-PAGE电泳,将分离的蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上,5%脱脂奶粉-TBST缓冲液进行膜封闭处理,一抗4℃孵育过夜(beta-actin 1 :1000,Jagged1 1 :300,Notch3 1 :400,Hes1 1 :400),TBST洗脱3次,加入相应的二抗(山羊抗小鼠1 :10000,山羊抗兔1 :5000),孵育1h,TBST浸泡PVDF膜,摇床上洗膜后,ECL发光试剂盒检测目的蛋白。采用Quantity one灰度分析软件分析,计算目的蛋白灰度值/β-actin灰度值即为目的蛋白相对表达量。
2.2.7 免疫组织化学染色采用链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)法,经脱蜡,高压修复后,封闭液孵育25min,滴加一抗(a-SMA和Hes1均为1 :200稀释),PBS冲洗后滴加生物素标记的二抗(1 :100)及链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物,DAB显色。阳性标本上用PBS代替一抗作阴性对照。Image Pro Plus 6.0图像分析系统测量肝组织平均积分吸光度(A)值[积分吸光/组织面积],用以代表阳性部位蛋白表达水平。
2.3 统计学方法采用SPSS16.0统计软件对数据进行分析,计量资料采用x±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD检验,相关分析采用Pearson相关,以P<0.05为有统计学意义。
3 结果 3.1 一般情况观察正常组大鼠毛发光泽,活跃好动,行动敏捷,食欲良好,体重持续增加。模型组大鼠随着时间延长,逐渐出现精神萎靡,毛发光泽度变差,运动缓慢,食欲减退等现象,从造模第16周开始出现体重不增加或增加缓慢,甚至负增长。肉眼观察正常组大鼠肝脏呈红褐色,光滑柔软,无颗粒物;模型组大鼠肝脏颜色暗红,质韧,边缘变钝,第20周及24周大鼠肝脏表面可见粗糙不平,呈沙粒状的颗粒物。与正常组相比,模型组从第16周开始肝脏指数增大,差异有统计学意义(P<0.05)。见表 2。
模型组大鼠ALT、AST、HA水平自造模第8周开始升高,PCⅢ、LN自第12周开始升高,与正常组相比差异有统计学意义(P<0.05)。见表 2。
3.3 各组大鼠肝组织Hyp水平变化模型组大鼠自造模第12周起Hyp含量升高,与正常组相比差异有统计学意义(P<0.05)。见图 1。
HE染色及Masson染色结果显示,正常组肝小叶结构完整清晰,细胞条索排列规整。模型组随着铜负荷时间延长,肝组织炎性反应、变性坏死、纤维组织增生呈进行性加重。造模第8周表现为肝细胞肿胀、脂肪变性、少量点灶状坏死、炎细胞浸润;第12周表现为脂肪变性、坏死加重, 可见炎细胞浸润、纤维组织开始增生;第16周表现为肝小叶结构紊乱,弥漫性脂肪变性,炎细胞浸润加重, 可见轻中度碎片样坏死,纤维条索形成。第20周表现为碎片状坏死伴少量桥接坏死,可见大量纤维条索及部分纤维间隔形成。第24周表现为碎片状坏死及桥接坏死加重,大量纤维间隔形成,可见部分假小叶。见图 2、3。
模型组自第12周开始Tgf-β1、Notch3、Hes1 mRNA表达升高,与正常组相比差异有统计学意义(P<0.05)。相关分析结果显示Notch3、Hes1mRNA与Tgf-β1mRNA表达水平呈正相关。见表 3。
蛋白印迹结果显示,模型组大鼠随着铜负荷时间延长,肝组织Jagged1、Notch3、Hes1蛋白表达量逐渐增加, 至24周假小叶形成达到高峰。Jagged1自造模第12周、Notch3自造模第16周、Hes1自造模第8周开始蛋白表达量增加,与正常组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图 4。
正常组Hes1蛋白较少表达于胆管上皮细胞及肝细胞,细胞膜及细胞质呈棕黄色染色,细胞核不着色;模型组随着造模时间延长,Hes1蛋白表达逐渐增加,在假小叶形成的第24周达到高峰,主要集中于肝纤维化区域,汇管区和靠近肝纤维化区域的肝细胞、胆管上皮细胞及炎性细胞亦有表达。肌成纤维细胞标志蛋白α-SMA在正常组大鼠的肝组织未见明显表达;模型组从第16周纤维条索形成开始表达显著增加,第24周达到顶点,集中于汇管区的纤维间隔或纤维条索。Hes1与α-SMA表达区域大部分重合于纤维化区域。见图 5、图 6。
蛋白平均吸光度(A)值结果显示,与正常组相比,模型组大鼠肝组织Hes1、α-SMA蛋白表达逐渐增加,纤维条索开始形成的第16周以后增加,到假小叶形成的第24周两者均达到高峰。相关分析显示Hes1与α-SMA蛋白表达量呈同步正相关(r=0.952,P<0.05)。见表 4。
Jagged/Notch信号通路进化上高度保守,通过相邻细胞之间的相互作用决定细胞分化、凋亡、增殖。国内外对Jagged/Notch信号通路与疾病研究以往主要集中在肿瘤、遗传性疾病等,近期发现该通路与肝纤维化的发生发展密切相关[10]。在新鲜分离的原代HSC细胞中可检测到Notch配体(Jagged1)及受体(Notch1、2、4)的基因表达,致肝纤维化关键因子TGF-β1刺激活化HSC细胞转化为肌成纤维细胞后,Notch1、Notch3 mRNA及蛋白表达呈上升趋势,a-SMA和Ⅰ型胶原表达增加[11-12]。在四氯化碳诱发肝纤维化模型,配体Jagged1,受体Notch2、Notch3和下游分子Hes1的mRNA表达增加,Notch信号活化形式NICD和Hes1在损伤的汇管区大量表达,应用Notch3特异性的siRNA抑制Notch3的表达可使肌成纤维细胞分泌功能明显降低[13]。目前对于HLD铜沉积引起的肝纤维化,尚无Jagged/Notch信号通路的相关研究。
肝脏是HLD铜蓄积主要靶器官,铜作为一种强氧化剂,长期过载可引起弥漫性肝细胞脂肪变性、活动性肝炎,刺激肝星状细胞活化为肌成纤维细胞,后者大量分泌胶原纤维、层黏蛋白等细胞外基质(ECM),导致肝损伤修复时ECM合成与降解不平衡,引起肝纤维化。
本文采用含1.5g/kg硫酸铜的粉状饲料和0.185%硫酸铜去离子水喂饲大鼠,发现随着铜在肝脏的蓄积,血清肝功能及肝纤维化指标、肝组织Hyp含量均呈动态增高趋势,病理学检查展现了从弥漫性脂肪变性、活动性肝炎到肝纤维化形成的完整过程,为研究HLD肝纤维化提供了一个参考模型。在此过程中,Jagged1/Notch3/Hes1信号通路持续被激活,下游靶基因Hes1在纤维化区域大量表达,与肌成纤维细胞标志蛋白a-SMA表达区域大部分重合,并随着肝纤维化的进行性加重而同步表达增加。由此我们认为铜沉积可以激活Jagged1/Notch3/Hes1信号通路,介导肝星状细胞转化为肌成纤维细胞并促其活化增殖,促使了肝纤维化的发生与发展。
通过本文结果,我们推断Jagged/Notch信号通路可能与HLD肝纤维化密切相关,开展相关研究,可以更好地认识HLD肝纤维化的发病机制,为寻找抗HLD肝纤维化的可能作用靶点提供重要线索。目前,铜沉积通过相邻细胞之间Jagged1/Notch3/Hes1信号通路,刺激肌成纤维细胞活化增殖的作用机制尚未清楚,我们将进一步深入研究。
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