诸葛菜(Orychophragmus violaceus L.Schulz)别名二月兰，系十字花科诸葛菜属植物，是一种分布广泛，生态适应性强的野生植物[1-2]。诸葛菜嫩叶和茎可食用，含胡萝卜素等多种营养成分，全草入药具有开胃下气、利湿解毒的功效[3]，现代药理研究表明，诸葛菜还有抑菌、抗肿瘤、促进消化、降低胆固醇等作用。总黄酮是其重要的生理活性物质，具有抗炎、抗辐射、抗氧化、免疫调节等作用。
超声辅助技术在中药提取中具有提取效率高，提取时间短，提取条件温和，绿色环保等优势[4-5]。本文采用超声辅助提取诸葛菜中总黄酮，通过Box-Behnken实验设计(Box-Behnken design，BBD)[6-7]，设计四因素三水平响应曲面分析方法优选超声提取工艺参数，并研究其抗氧化活性，为诸葛菜进一步的开发利用提供依据和参考。响应曲面法通过建立连续变量的模型，对各影响因素及交互作用进行优化和评价，同时用曲面图和等高线图表示出来，比正交设计更直观、精确。该方法现已广泛用于中药提取、食品工业等领域的工艺优化。
1 仪器与材料 1.1 仪器102-2A型电热鼓风干燥箱(龙口市先科仪器公司)；JJ224BC电子天平(美国G&G公司)；JDH-2G微波干燥杀菌箱(广州永泽微波能设备有限公司)；CS-700高速多功能粉碎机(永康市天棋盛世工贸有限公司)；KQ-500DB数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；UV-1901双光束紫外可见分光光度计(郑州科泰实验设备有限公司)。
1.2 材料诸葛菜(本品于2017年4月、5月、6月采集于济宁医学院日照校区本草园，经济宁医学院药学院王建安副教授鉴定为十字花科诸葛菜属植物诸葛菜 Orychophragmus violaceus L.Schulz，干燥，粉碎，过60目筛，置干燥器内保存备用)；芦丁对照品(批号：20150701)购于中国食品药品检定研究院；D4313 DPPH(批号：AYSJB-IQ)购于东京化成工业株式会所；AR抗坏血酸(批号：20120910)购于江苏强盛功能化学股份有限公司；亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝、乙酸钠、结晶乙酸钠、三氯化铝、乙酸试剂均为分析纯。
2 方法与结果 2.1 诸葛菜总黄酮的测定 2.1.1 对照品溶液的制备精密称定芦丁对照品20.00mg于100ml容量瓶中，加入60%乙醇溶解，定容至刻度，摇匀，即得浓度为0.20mg/mL的芦丁对照品溶液。
2.1.2 供试品溶液的制备将采集于济宁医学院日照校区本草园花蕾期的诸葛菜，低温干燥，粉碎，过60目筛，精密称取0.5000g置于50ml具塞锥形瓶中，加入60%乙醇20ml，超声提取30min，抽滤，即得供试品溶液。
2.1.3 标准曲线的绘制和线性范围精密吸取芦丁标准溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5ml于25ml容量瓶中，用60%乙醇补充至5.0ml，加入0.1mol/L AlCl3溶液4.0ml，pH 5.4 NaAc-HAc缓冲溶液4.0ml，40 ℃水浴显色20min，室温放置10min后用60%乙醇定容至刻度，采用紫外可见分光光度计于410nm处测其吸光度，以芦丁对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线得线性回归方程为y=26.786x+0.0199 (R2=0.9992)，结果表明芦丁在4~28 g /ml范围内线性关系良好。
2.1.4 精密度试验取同一供试品溶液，按2.1.3项下的方法，连续测定6次，计算总黄酮吸光度的RSD为0.61%(n=6)，表明精密度良好。
2.1.5 稳定性试验取同一供试品溶液，按2.1.3项下的方法，分别在0、10、20、30、60、90、120min时各测定1次，计算总黄酮吸光度的RSD为1.07%(n=6)，结果表明供试品溶液在120min内稳定性良好。
2.1.6 重复性试验精密称定诸葛菜粉末6份，每份0.5000g于50ml具塞锥形瓶中，分别加入20ml 60%乙醇，超声提取30min，抽滤，记录滤液体积，精密吸取上述样品溶液1.0ml置25ml容量瓶中，用60%乙醇补足至5.0ml，按2.1.3下的显色方法显色，在410nm处测定吸光度，计算总黄酮平均含量为14.15mg/g，RSD为1.03%(n=6)，表明该方法重复性良好。
2.1.7 加样回收率试验精密称定已知含量的诸葛菜粉末6份，每份0.2500g，分别精密加入一定量的芦丁对照品，依法制备供试品溶液进行测定，测得芦丁的平均回收率为102.22%，RSD为1.63%，表明该方法准确性良好。
2.2 超声提取诸葛菜总黄酮工艺研究 2.2.1 单因素试验1) 超声温度对总黄酮提取率的影响采用乙醇浓度60%，料液比1 :40，超声时间30min，超声提取诸葛菜总黄酮，考察不同超声温度(20、30、40、50、60、70 ℃)对总黄酮提取率的影响。见图 1。
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图 1 超声温度对总黄酮提取率的影响 |
图 1表明，随超声温度的增加，总黄酮提取率逐渐提高，当温度达到40 ℃，总黄酮提取率达到最大，之后总黄酮提取率随温度升高而降低，因此最佳超声温度选择40 ℃。
2) 料液比对总黄酮提取率的影响：采用乙醇浓度60%，超声温度40 ℃，超声时间30min条件提取诸葛菜总黄酮，考察不同料液比1 :30、1 :40、1 :50、1 :60、1 :70对总黄酮提取率的影响。见图 2。
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图 2 料液比对总黄酮提取率的影响 |
由图 2可知，诸葛菜总黄酮提取率随料液比的增加而升高，当料液比为1 :50时总黄酮提取率达到最高，其后随料液比升高提取率下降，因此最佳料液比选取1 :50。
3) 超声时间对总黄酮提取率的影响：采用料液比1 :50，乙醇浓度60%，超声温度40 ℃条件超声提取总黄酮，考察不同超声时间30、40、50、60、70min对诸葛菜总黄酮提取率的影响。见图 3。
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图 3 料液比对总黄酮提取率的影响 |
图 3表明，随超声时间的延长，诸葛菜总黄酮提取率逐渐增大，总黄酮提取率在50min时达到最大，其后随时间的增加总黄酮提取率逐渐降低，因此50min为最佳提取时间。
4) 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响：采用料液比1 :50，超声温度40 ℃，超声时间50min条件提取总黄酮，研究乙醇浓度40%、50%、60%、70%、80%、90%对总黄酮提取率的影响。见图 4。
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图 4 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响 |
图 4表明，随着乙醇浓度的增大，诸葛菜中总黄酮提取率逐渐升高，当乙醇浓度达70%时，总黄酮提取率达到最高，其后随乙醇浓度的增大，总黄酮提取率降低，因此最佳乙醇浓度为70%。
2.2.2 响应曲面优化试验在单因素试验的基础上，利用Design Expert 8.0.6软件，依据Box-Behnken试验设计原理，选择料液比(A)、超声时间(B)、乙醇浓度(C)、超声温度(D)影响总黄酮提取率的四个主要因素，以诸葛菜总黄酮含量为响应值，进行试验分析。试验因素水平编码设计及试验结果见表 1、2、3。
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表 1 响应曲面设计因素与水平表 |
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表 2 响应曲面中心组合方案与响应值 |
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表 3 二次回归模型的方差分析结果 |
如表 3方差分析所示，乙醇浓度(P＜0.001)、超声温度(P＜0.001)对诸葛菜总黄酮提取率有极显著性影响，料液比(P＜0.05)对诸葛菜总黄酮提取率有显著性影响，而超声时间影响不显著，AC、A2、B2、C2、D2是显著型模型。
以总黄酮含量为响应值，经回归拟合后，得到回归方程：总黄酮含量=21.51+0.56A+0.28B-1.60C-1.90D-0.12AB+1.03AC+0.3AD-0.65BC-0.73BD-0.37CD-3.10A2-3.40B2-3.69C2-4.90D2，根据方差结果显示，F回归=47.63，P＜0.0001，表明二次多元回归方程与响应值之间的关系模型显著，差拟项检验值P=0.4642>0.05(不显著)，R2=0.9031，说明模型充分拟合试验数据，可用此回归方程确定诸葛菜总黄酮的最佳提取工艺。
2.2.3 效应面分析通过多元回归方程绘制效应曲面图，可以直观的反应各因素及两两因素间的交互作用对响应值的影响，效应曲面图见图 5。
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图 5 料液比(A)、超声时间(B)、乙醇浓度(C)与超声温度(D)两两交互作用对总黄酮提取率影响的效应曲面图 |
如图 5所示，三维空间曲面直观反映了各变量交互作用对总黄酮提取率的影响，随着A、B、C、D值的增大，总黄酮提取率逐渐提高，当达到最大值后，随着各变量值的继续增大，总黄酮提取率有所下降。通过Design-Expert 8.0.6软件进行分析，诸葛菜总黄酮最佳提取工艺条件为料液比1 :50，超声时间50.80min，乙醇浓度67.92%，超声温度38.09℃，此条件下总黄酮提取率为21.88mg/g，考虑到实际操作需要，将实验条件修订为料液比1 :50，超声时间51min，乙醇浓度70%，超声温度39℃。在此最优实验条件下进行3次验证试验，诸葛菜总黄酮平均提取率为21.83mg/g，与理论预测值21.88基本吻合，偏差很小，说明该模型可靠，利用响应面分析法优化得到的超声提取工艺参数准确，具有可行性。
2.3 诸葛菜总黄酮含量及抗氧化活性结果比较 2.3.1 体外抗氧化活性测定精密称取DPPH 8.0mg于100ml棕色容量瓶中，用无水乙醇溶解并定容到刻度，配成浓度为2.0×10-4mol/L DPPH溶液，将样品溶液配成浓度分别为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1、0.15mg/ml，分别加入DPPH溶液或无水乙醇后避光反应60min后于510nm处测定吸光度。按照以下公式计算诸葛菜总黄酮对DPPH·清除率[8-10]。用相同浓度Vc做阳性对照。
DPPH·清除率%= ×100%
A1：样品溶液+DPPH溶液，A2：样品溶液+无水乙醇，A0：无水乙醇+DPPH溶液
2.3.2 不同生长时期诸葛菜总黄酮含量及抗氧化活性比较将诸葛菜花蕾期、初花期、大花期及结果期的新鲜药材置于阴凉通风处干燥，粉碎，过60目筛，分别精密称定上述干燥药材粉末3份，每份0.5000g于50ml具塞锥形瓶中，加入70%乙醇25ml，在38℃下超声提取51min，抽滤，取滤液，显色后测定吸光度，计算总黄酮含量，按2.3.1测定体外抗氧化活性。见图 6，7。
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图 6 不同生长期诸葛菜总黄酮含量比较 |
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图 7 不同生长期诸葛菜抗氧化活性比较 |
由图 6可知，不同生长期诸葛菜总黄酮含量：花蕾期＞初花期＞大花期＞结果期，由图 7所示，不同生长期诸葛菜总黄酮对DPPH自由基清除能力均随着样品溶液浓度增大而增加，在10~50μg/ml增长幅度较大，超过50μg/ml时，逐渐趋于平缓。由此可知，花蕾期总黄酮含量及抗氧化活性最高。
2.3.3 不同药用部位诸葛菜总黄酮含量及抗氧化活性比较将大花期诸葛菜新鲜药材根、茎、叶、花、果实分离，分别置微波干燥杀菌箱中45℃下微波干燥，将干燥后药材分别粉碎，过60目筛，按2.3.1方法测定总黄酮含量及体外抗氧化活性。结果见图 8，9。
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图 8 不同药用部位诸葛菜总黄酮含量比较 |
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图 9 不同药用部位诸葛菜抗氧化活性比较 |
由图 8可知，不同药用部位诸葛菜总黄酮含量：叶＞花＞茎＞根＞果实，由图 9可知，不同药用部位诸葛菜总黄酮对DPPH自由基清除能力均随着样品溶液浓度增大而增加，在10~50μg/ml增长幅度较大，超过50μg/ml时，逐渐趋于平缓。由此可知，叶的总黄酮含量及抗氧化活性最高。
2.3.4 不同干燥方法诸葛菜总黄酮含量及抗氧化活性比较将置于不同干燥方法下干燥后的大花期诸葛菜药材粉碎，过60目筛，按2.3.1方法测定总黄酮含量及体外抗氧化活性。结果见图 10，11。
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图 10 不同干燥方法诸葛菜总黄酮含量比较 |
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图 11 不同干燥方法诸葛菜抗氧化活性比较 |
由图 10可知，不同干燥方法诸葛菜总黄酮含量：低温鼓风干燥＞微波干燥＞阴干，由图 11所示，不同干燥方法诸葛菜总黄酮对DPPH自由基清除能力在10~50μg/ml范围内呈较好的量效关系。阴干法清除能力可达84.96%，微波干燥法为83.58%，低温鼓风干燥为81.76%。虽然阴干法抗氧化活性最高，但总黄酮含量相对较低；低温干燥法和微波干燥法抗氧化活性差异较小，其中，阴干法总黄酮含量相对较高，因微波干燥法所需时间较短，因此选择微波法作为诸葛菜最佳干燥方法。
3 讨论本课题在单因素试验的基础上，采用响应曲面法优化诸葛菜总黄酮超声提取工艺，试验结果表明：在料液比1 :50、超声时间51min、超声温度38℃、乙醇浓度68%条件下，诸葛菜中总黄酮含量为21.83mg/g，与模型预测值基本相近，从而说明该方法可行。通过对比不同干燥方法，不同药用部位和不同生长期诸葛菜总黄酮含量和抗氧化活性，选择微波法干燥，叶和花蕾期总黄酮含量和抗氧化活性相对较高。本文通过对诸葛菜总黄酮提取工艺及抗氧化活性的研究，为诸葛菜有效成分的进一步开发利用提供理论依据。
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