基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是一组可以参与到结缔组织的破坏与重构的酶家族。目前人们已经进行了大量关于MMPs基因多态性的研究，其中包括动脉粥样硬化、脑栓塞和肿瘤等，但关于心力衰竭(chronic heart failure, CHF)方面的研究比较少^[1-2]。我们前期的研究工作发现，rs243866位点A等位基因可降低MMP-2转录活性，从而可以降低CHF的发生易感性^[3]；而rs17576位点AG基因型可以引得精氨酸至谷氨酰胺的氨基酸变化，进而增加个体CHF发病风险^[4]；此外，rs1799750位点的1G等位基因以及单体型1G6A会降低个体CHF发病风险^[5]。虽然在人类的心肌组织中存在着多种MMPs, 但当CHF发生时并不是每一种MMPs都会升高。我们查阅中国国际人类基因组单体型图计划(简称HapMap计划)数据库以及美国国立生物技术信息中心(NCBI)的dbSNP数据库又筛选出MMPs基因启动子区 rs225207、rs2285053、rs243865、rs11225395及rs11568818 5个SNPs，探讨与CHF发病风险的关联性。

选择收治到新乡医学院第三附属医院的160例慢性CHF患者为观察组，其中男84例，女76例，年龄58~79岁，平均年龄(61.1±8.5)岁。以同期住院的非CHF心脏病患者(同时除去其患有感染性，血液性、肝肾功能不全、恶性肿瘤等疾病)186例为对照组，其中男97例，女89例，其年龄52岁~78岁，平均年龄(60.7±8.7)岁，所有对象知情同意并签署同意书，且均为三代以上居住在河南新乡地区。

凝胶成像分析系统(Bio-Rad公司，美国)、Qubit核酸蛋白定量分析试剂盒(Invitrogen生物公司)、PCR仪(Biometra公司，德国)、台式高速冷冻离心机(Eppendoff公司，德国)、Taq酶(上海生物工程有限公司)、SNPs位点扩增引物(Invitrogen生物公司)、多功能电泳仪(Phannacia公司，瑞典)、限制性内切酶Hinf Ⅰ、Xsp Ⅰ、EcoR Ⅰ、BglⅡ。

所有研究对象统一填写调查表，再由监督人员核验每一份调查表，确保信息无误。

空腹10 h过夜后，清晨6:00取受试者外周静脉血8 ml，其中3 ml用于血脂等生化指标测定、5 ml用于基因组DNA提取。采用现行标准化方法进行血生化指标检测，由新乡医学院第三附属医院检验科完成并进行质量控制。

采用有机酚/氯仿法提取外周血基因组DNA，Qubit核酸蛋白定量分析试剂盒检测所提取DNA的质以及量，然后保存到-20℃冰箱备用。

包含10×Buffer，1.5mmol/L MgCl₂，0.2mmol/L dNTPs，10μmol/L引物，50ng~100ng DNA模版，1U Taq Plus DNA聚合酶，总体积共为25μl。热循环参数：95℃预变性2min后，94℃变性45s，退火温度变异范围(见表 1)45s，72℃延伸45s，共计32个循环, 最后72℃延伸10min。

表 1

表 1 MMPs基因5个SNPs位点基本信息 SNPs 引物序列 退火温度 限制性内切酶 rs2285053 F:GGATTCTTGGCTTGGCGCAGGA R:GGGGGCTGGGTAAAATGAGGCTG 61℃ Hinf Ⅰ rs225207 F:GATACGTTCTTACAGAAGGC R:GACAAATCATCTTCATCACC 58℃ Xsp Ⅰ rs243865 F:CTTCCTAGGCTGGTCCTTACTGA R:CTGAGACCTGAAGAGCTAAAGAGCT 55℃ Xsp Ⅰ rs11568818 F:TGGTACCATAATGTCCTGAATG R:TCGTTATTGGCAGGAAGCACACAATGAATT 55℃ EcoR Ⅰ rs11225395 F:GCCAGAGACTCAAGTGGGAGACTACCATGCAGATC R:TTATGATTGCCCAGACATTTC 58℃ BagⅡ

表 1 MMPs基因5个SNPs位点基本信息

采用限制性内切酶片段长度多态性(polymerase chain reaction–restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)技术对SNPs进行分型。酶切反应总体系10：其中包含PCR扩增产物5.0，相应的内切酶1U，1×内切酶缓冲液，最后超纯水补充，然后37℃水浴16h；6%聚丙烯酰胺凝胶(polacryamide gel electrophoresis，PAGE)电泳检测酶切产物取3.0电泳上样，同时加入PCR扩增产物(未经酶切)以及500bp DNA Marker作为内参，恒压400V，1h(各SNPs所用限制性内切酶见表 1)，硝酸银染色。

运用SHEsis软件比较每个SNP点在观察组与对照组间频率以及频数分布，OR和95%可信区间(95%CI)、样本的群体代表性应用Hardy-Weinberg平衡表示，检验水准α=0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

MMPs基因启动区5个SNP位点各基因型在对照组中Hardy-Weinberg平衡结果表明，rs2285053、rs11225395及rs225207这3个SNP的基因型频率在观察组和对照组人群中符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)，其中rs2285053位点χ²=0.05，P=0.95；rs11225395位点χ²=012，P=0.88；rs225207位点χ²=0.09，P=0.90。本文中rs243865位点基因型全部为CC，rs11568818位点基因型全部为AA，可能该位点在河南汉族人群中无多态性，因此不予分析。

本研究根据电泳图谱出现条带判定基因型。本次研究中rs243865、rs11568818未表现出多态性。而rs2285053、rs11225395、rs225207这3个SNPs位点等位基因电泳图谱如图 1-3。5个SNPs位点引入的酶切位点及内切酶。见表 2。

图 1

图 1 rs2285053等位基因PAGE电泳图谱 注：1 PCR产物；2 TT；3 CT；4 CC；5 空白对照

图 2

图 2 rs11225395等位基因PAGE电泳图谱 注：1 PCR产物；2 TT；3 CC；4 CT；5 空白对照

图 3

图 3 rs225207等位基因PAGE电泳图谱 注：1 PCR产物；2 AA；3 AG；4 GG；5 空白对照

表 2

表 2 MMPS上5个SNPs位点等位基因及内切酶 SNPs 无酶切位点及等位基因 酶切后片段大小及等位基因 限制性内切酶 rs2285053 391 bp C 338 bp 53 bp T HinfI rs243865 192 bp C 162 bp 26 bp T XspI rs225207 445 bp G 244 bp 201 bp A XspI rs11225395 255 bp C 120 bp 30 bp T BagⅡ rs11568818 150 bp A 120 bp 30 bp G EcoRI

表 2 MMPS上5个SNPs位点等位基因及内切酶

MMPs基因启动子区5个SNPs的多态性与CHF的相关性如表 3、4。结果显示观察组rs225207的等位基因A的频率显著降低(P＜0.05)，rs2285053位点T等位基因两组比较有统计学意义(P＜0.05)；AA基因型在两组中差异有统计学意义(P＜0.05)；rs11225395位点的T等位基因的频率在观察组明显降低(P＜0.05)，TT基因型频率降低(P＜0.05)；rs243865及rs11568818这两个SNPs位点的在两组基因型完全一样没有多态性，在此不予分析。

表 3

表 3 MMPs基因启动区5个SNPs位点基因型在两组中的频率分布(n/%) SNPs rs2285053 rs11225395 rs225207 CC CT TT CC CT TT AA AG GG 观察组 120(75.0) 33(20.6) 7(4.4) 71(44.4) 81(50.6) 8(5.0) 14(8.9) 80(50.0) 66(41.1) 对照组 105(66.0) 45(28.3) 9(5.7) 45(25.9) 104(56.0) 31(18.1) 48(25.8) 94(50.5) 18(23.7) χ2 3.723 9.529 9.853 P 0.155 0.009* 0.007* OR(95%CI) 1.941(1.013~3.721) 2.012(1.695~3.948) 2.076(1.583~4.422) 注：与对照组相比，*P＜0.05

表 3 MMPs基因启动区5个SNPs位点基因型在两组中的频率分布(n/%)

表 4

表 4 MMPs基因启动区5个SNPs位点等位基因在两组中的频率分布(n/%) SNPs rs2285053 rs11225395 rs225207 C T C T A G 观察组 273(85.3) 47(14.7) 223(67.9) 97(30.3) 109(34.1) 211(65.9) 对照组 298(80.1) 74(19.8) 201(54.0) 171(46.0) 189(50.8) 183(49.2) χ2 4.09 8.264 9.508 P 0.043* 0.004* 0.002* OR(95%CI) 0.683(0.367~1.435) 1.966(1.236~3.129) 0.499(0.320~3.779) 注：与对照组相比，*P＜0.05

表 4 MMPs基因启动区5个SNPs位点等位基因在两组中的频率分布(n/%)

用SHEsis软件统计分析，推断出rs2285053、rs11225395及rs225207构建成8种单体型，通过进一步比较，结果显示，单体型CCG的频率在两组间存在显著差异(P＜0.05)。见表 5。

表 5

表 5 MMPs基因启动区3个SNPs位点单倍型分析(%) 单体型 CCG CCA CTG CTA TTA TCA TCG TTG 对照组 20.6 22.6 19.2 19.6 5.2 5.1 5.2 2.5 观察组 42.5 16.6 15.4 12.6 3.2 3.1 6.2 0.0 χ2 15.955 1.449 0.468 1.595 0.449 0.43 0.088 1.684 P 6.55e-005* 0.229 0.494 0.207 0.503 0.512 0.767 0.194 OR (95%CI) 2.854 (1.690~4.820) 0.683 (0.367~1.273) 0.766 (0.357~1.646) 0.594 (0.263~1.342) 0.597 (0.130~2.743) 0.599 (0.127~2.819) 1.197 (0.364~3.939) 0.001 (0.000~0.019) 注：与对照组相比，*P＜0.05

表 5 MMPs基因启动区3个SNPs位点单倍型分析(%)

CHF是常见的临床综合症，是目前心血管系统疾病患者生活质量低下及死亡的重要原因之一^[6]。CHF病因和发病机制仍在进一步的研究当中，其中基因多态性已成为研究热点^[7]。MMPs是一类ECM降解所必需的蛋白水解酶，可以参与到多种疾病的形成当中，尤其是心血管疾病。随着临床和实验室研究的不断深入，已发现MMPs与多种心血管疾病的发生、发展有密切关联，并且其受基因调控^[8]。

MMP-2几乎存在于所有心肌细胞，研究表明MMP-2可降解肌钙蛋白，损伤心肌收缩力。CHF患者MMP-2水平的改变与死亡率有着直接关系^[9]，故针对如何改变MMP-2活性从而影响CHF发病率的研究也越来越多。本文结果显示，在河南新乡地区汉族群体中观察组rs2285053位点T等位基因的频率与对照组相比降低。分析其原因可能是rs2285053位点C/T等位基因的改变，可以使基因启动子区的Sp1位点的特异性序列变化，进而影响MMP-2基因转录水平^[10]，减少损害心肌肌原纤维的作用，降低个体CHF危险患病风险。

研究证实MMP-8的ApoE基因敲除后会减少小鼠动脉粥样硬化的程度，降低血清血管紧张素Ⅱ水平，并在病变血管处细胞黏附分子-1表达减少^[11]。本文得出观察组rs11225395位点的T等位基因的频率与对照组相比降低(P＜0.05)，OR=1.966, 提示T等位基因降低个体CHF危险。基因功能学提示rs11225395基因位于MMP-8基因第2外显子，C-T的替换可引起MMP-8的前肽结构中第87位氨基酸谷氨酸转变为赖氨酸，从而使得MMP-8的转录活性增高2~3倍，使得细胞外基质分解明显增加^[12]，从而降低了心力衰竭的易感性。

研究表明，MMP-13在某种程度上使MMP-2和MMP-9激活，进而可以破坏ECM和直接损害心肌，但也可以导致纤维连接素以及胶原蛋白降解，产生抑制心肌纤维化的作用^[13]。本文结果显示，观察组rs225207的G等位基因的频率与对照组相比明显增加(P＜0.05)。随着G等位基因频率的增加，间接下调了MMP-13转录水平，可能增加个体CHF危险。

多个SNP可能会降低单个位点对该疾病的影响，也可能会联合诱发疾病。我们使用SHEsis分析rs17860523、rs11225395及rs225207之间的连锁作用, 及其与河南汉族群体CHF之间的相关性。得出三者一共构建成8种单体型，各个单体型在两组频率均>0.01，结果显示单体型CCG的频率在两组中比较差异有统计意义(P＜0.05)，OR=2.854(95%CI=1.690~4.820)，相比单个SNP的研究更加有意义。说明单体型CCG可能是CHF个体的预后不良因素之一，而其他观察到的单体型可能与CHF个体预后没有相关性(P＞0.05)。

综上所述，本文提示在河南新乡地区汉族群体中rs225207位点的G等位基因及rs2285053、rs11225395及rs225207组成的单体型CCG可能会增加CHF的患病风险；rs11225395、rs2285053位点的T等位基因可能会降低CHF的患病风险；而rs243865、rs11568818这两个位点在河南新乡地区汉族群体中无多态性。