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  济宁医学院学报  2017, Vol. 40 Issue (6): 402-406  DOI:10.3969/j.issn.1000-9760.2017.06.004
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郑桂芝, 梁汝庆, 郑灿磊, 于斌, 孙闵, 孙冰. 艾灸对脑缺血-再灌注损伤大鼠MMP-9表达的影响[J]. 济宁医学院学报, 2017, 40(6): 402-406. DOI: 10.3969/j.issn.1000-9760.2017.06.004.
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ZHENG Guizhi, LIANG Ruqing, YU Bin, ZHENG Canlei, SUN Min, SUN Bing. Effect of moxibustion on MMP-9 expression in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury[J]. Journal Of Jining Medical University, 2017, 40(6): 402-406. DOI: 10.3969/j.issn.1000-9760.2017.06.004.
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基金项目

山东省中西医结合临床重点学科资助项目;济宁医学院青年基金资助(JYQ2011KM046)

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收稿日期:2017-11-23
艾灸对脑缺血-再灌注损伤大鼠MMP-9表达的影响
郑桂芝1, 梁汝庆2, 郑灿磊1, 于斌1, 孙闵1, 孙冰1    
1. 济宁医学院中西医结合学院, 济宁 272067;
2. 济宁医学院附属医院, 济宁 272029
摘要: 目的 观察艾灸对脑缺血-再灌注损伤大鼠血清MMP-9含量的影响。方法 将SD大鼠随机分为模型组、艾灸组和假手术组,每组15只,神经行为学评分评判造模以及不同时间点艾灸干预神经功能恢复情况,ELISA检测血清MMP-9含量,Western Blot检测脑组织中MMP-9表达。结果 艾灸干预后,艾灸组神经功能缺损评分较模型组明显降低(P < 0.05);艾灸组血清MMP-9含量和脑组织MMP-9表达较模型组明显降低,差异具有统计学意义(P < 0.05)。结论 艾灸对脑缺血-再灌注损伤大鼠神经功能有显著改善作用,其机制可能是通过调节血清和脑组织MMP-9表达量的变化,从而保护血管内皮细胞损伤。
关键词: 艾灸    脑缺血-再灌注损伤    基质蛋白酶9    
Effect of moxibustion on MMP-9 expression in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury
ZHENG Guizhi1, LIANG Ruqing2, YU Bin1, ZHENG Canlei1, SUN Min1, SUN Bing1    
1. College of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine of Jining Medical University, Jining 272067, China;
2. Affiliated Hospital of Jining Medical University, Jining 272029, China
Abstract: Objective To observe the effect of moxibustion on the expression of MMP-9 in cerebral ischemia-reperfusion injury rats. Methods SD rats were divided into model group, moxibustion group and Sham-operation group randomly (n=15).Neurobehavioral score was used to evaluate the situation of modeling.After moxibustion, the recovery of nerve function at different time points, the content of MMP-9 in serum were detected by ELISA, and the expression of MMP-9 in brain tissue was detected by Western Blot. Results After moxibustion, the neurological score in moxibustion group was significantly lower than that in the model group (P < 0.05).The MMP-9 expression in serum and brain tissue in the moxibustion group were significantly lower than those in the model group (P < 0.05). Conclusion Moxibustion can significantly improve neurological function in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury.The mechanism may be the protection of vascular endothelial cell injury by changing the expression of MMP-9 in serum and brain tissue.
Key words: Moxibustion    Cerebral ischemia-reperfusion injury    Matrix metalloproteinase-9    

脑血管疾病是目前严重威胁人类健康和生命的主要疾病,其中缺血性脑血管病约占全部脑血管疾病患者的80%。临床大多由大脑中动脉阻塞引起急性血液循环障碍,导致突发性局灶性脑功能障碍,引起感觉、运动功能减退或丧失,甚至死亡,是神经内科常见病和多发病,具有高发病率、高死亡率、高致残率、高复发率的特点。研究表明[1-2],缺血性脑血管病的发生有许多炎症因子参与,其中基质金属蛋白酶类(matrixmetallopro-teinases, MMPs)尤其是基质金属蛋白酶9(MMP-9)的升高,对血管内皮细胞损伤性增强,从而导致缺血性脑病的发生。血管内皮细胞损伤是其共同的病理基础。中医认为本病发病的基本病机是本虚标实,风、火、痰、瘀等是其标,脏腑气血虚弱,阴阳失调是其本。针灸作为中国传统治疗方法,在脑血管疾病防治研究中得到了长足的发展,同时针灸治疗缺血性中风作用机理的实验研究也不断深入。临床实践表明,艾灸治疗急性缺血性中风具有较好的疗效[3-8]。本实验采用脑缺血-再灌注损伤模型,模拟人类多次短暂性脑缺血发作类型,探讨艾灸类人迎穴对脑缺血-再灌注损伤大鼠血管内皮细胞的保护作用。

1 材料与方法 1.1 实验动物与分组

SD大鼠,雄性,清洁级,体质量220~280g,由上海中医药大学实验动物中心提供(合格证编号:JZDW2014-0336)。实验过程中对动物的处置符合实验动物伦理学标准。大鼠于饲养笼内适应性饲养1周,清洁饮水,自由摄食等。用电脑SPSS软件用随机数字法将其随机分为模型组(即脑缺血-再灌注损伤组)、艾灸组(即艾灸脑缺血-再灌注损伤组)、假手术组,每组各15只。

1.2 主要试剂与仪器

680型酶标仪(BIO-RAD);MMP-9试剂盒(碧云天公司,C1002);RIPA组织细胞快速裂解液(Solarbio,R0010);BCA蛋白定量试剂盒(thermo,PICPI23223);NC膜(Millipore,HATF00010);蛋白预染Marker (Fermentas,SM1811);发光液(Millipore,WBKLS0100);Tween-20(Amresco,BYL40713);丽春红染液(上海基尔顿生物,BYL40635)。

1.3 方法 1.3.1 脑缺血-再灌注损伤模型的制备

模型组和艾灸组大鼠以2%戊巴比妥钠(30mg/kg),腹腔注射麻醉后,仰卧位固定头部和四肢,常规剃毛,消毒,沿颈部正中作一长度约2.0cm切口,逐层钝性分离,分离双侧颈总动脉(CCA),以无创动脉夹夹闭CCA近心端3min,间隔30min,再夹闭3min,共夹闭3次,缝合颈部切口,建立脑缺血-再灌注损伤模型。假手术组只分离颈总动脉,不夹闭,其他同模型组。

1.3.2 神经病学评分及纳入标准

参照Longa等[9]5级标准评分法。0分:无神经功能缺损;1分:缺血对侧前肢内收、不能完全伸展;2分:行走时向偏瘫侧转圈者;3分:行走时向偏瘫侧倾倒;4分:意识丧失,不能自发行走。动物出现神经功能缺损,无烦躁不安、抬头狂体征,1~3分为模型成功,0分和4分予以剔除;癫痫发作者,取材时发现脑出血、蛛网膜下腔出血者均剔除,随机补充。

1.3.3 处理方法

术后均给予单只大笼饲养。艾灸组于模型建立6h开始用特制动物艾条(直径0.5cm,长度12cm,河南南阳汉医艾绒有限责任公司生产)艾灸类人迎穴(大鼠穴位中无此穴,取穴方法模仿人体人迎穴定位方法,具体定位为甲状腺两侧,颈动脉搏动处。具体定位如图 1所示),每次15min,每天1次,共治疗7d。模型组和假手术组只做与艾灸组相同的固定,不做任何处理。

图 1 大鼠取穴定位图
1.3.4 标本采集

每组分别于造模后6h和第3d各随机抓取5只,先行神经功能缺损评分,然后用2%戊巴比妥钠(30mg/kg),腹腔注射麻醉后,仰卧位固定头部和四肢,腹主动脉抽血处死,将血置于枸橼酸钠抗凝试管内,摇匀。然后,断头,取脑。7d后将剩余的大鼠用上述同样的方法处理并取材。整个过程符合动物伦理学要求。

1.3.5 ELISA检测MMP-9含量

具体方法:将大鼠禁食12h后,腹主动脉抽取血5mL,置于枸橼酸钠抗凝试管内,摇匀,室温静置40min,离心15min(3000 r·min-1),分离血清置入EP管,-80℃冰箱保存,统一检测。严格按照试剂盒说明操作。检测结果见表 2

表 1 3组大鼠不同时间点神经行为学评分比较(分,x±s)
表 2 3组大鼠在不同时间点血清MMP-9含量比较(ng/ml,x±s)
1.3.6 Western Blot检测脑组织中MMP-9表达

具体操作步骤:将各组脑组织用裂解液充分裂解,离心(4℃,12000 r/min,5min),BCA方法蛋白定量,取20μL总蛋白加入上样缓冲液煮沸变性,经PAGE凝胶电泳,然后转膜,用5%脱脂奶粉封闭后,加入一抗、二抗孵育,ECL发光液显色,成像系统扫描、拍照。检测结果如图 2所示。

图 2 各组大鼠在不同时间点脑组织MMP-9表达 注:与假手术组比较,*P<0.05;
与模型组比较,#P<0.05。
1.4 统计学方法

采用SPSS22.0统计软件进行分析,计量资料用均数±标准差(x±s)表示,组间比较用单因素方差分析。检验水准α=0.05, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组大鼠不同时间点神经行为学评分

假手术组在造模后6h、3d和7d的神经行为学评分均为0,也就是假手术不能对大鼠肢体运动产生影响;模型组和艾灸组在造模后6h和造模后3d,神经行为学评分均较高,两组比较无差异(P>0.05),与假手术组比较,均有差异性(P<0.05)。在造模后7d,艾灸组神经行为学评分明显降低,与模型组比较有统计学差异(P<0.05)。见表 1

2.2 各组大鼠不同时间点血清MMP-9含量

在造模后6h,与假手术组比较,模型组和艾灸组血清中MMP-9含量明显升高(P<0.05);在造模3d和7d后,与假手术组比较,模型组和艾灸组血清中MMP-9含量仍较高(P<0.05),与模型组比较,艾灸组血清中MMP-9含量明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。见表 2

2.3 各组大鼠不同时间点脑组织MMP-9表达

在造模后6h,与假手术组比较,模型组和艾灸组脑组织中MMP-9表达较高(P<0.05);在造模3d和7d后,与假手术组比较,模型组脑组织中MMP-9蛋白表达仍较高(P<0.05),与模型组比较,艾灸组脑组织中MMP-9表达明显下降(P<0.05)。见图 2

3 讨论

缺血性脑卒中严重危害着人类的健康与生存质量。脑缺血后可引发炎性反应,已有的研究表明[10-12],MMP-9作用于血管基底膜成分,参与了缺血性脑卒中后炎性反应以及继发性脑损伤的病理过程。MMPs是一组依赖Ca2+和Zn2+的中性蛋白酶家族,MMP-9属明胶酶,是神经系统中最为重要的MMP,主要作用为降解血管周围基膜的Ⅳ型明胶胶原、层粘连蛋白、纤粘连蛋白等绝大部分细胞外基质。脑缺血时,MMP-9能降解脑血管基质的关键成分,使血脑屏障通透性增加,导致大量的水、电解质和蛋白质外流,最终形成血管源性脑水肿和神经元损坏。如大量活化的白细胞通过破坏损伤的血脑屏障渗入到脑组织内,可释放许多细胞因子、炎症介质,加速神经元的损伤,加重缺血性脑损害。

艾灸作为中国传统疗法,具有简单易行、经济有效等特点。大鼠类人迎穴的定位从解剖位置上来看,位于甲状腺两侧,颈动脉搏动处。艾灸此穴扩张颈部血管,增加血流,从而改善脑部血液循环。但目前人们研究的重点多集中在针刺能够显著改善缺血性脑卒中模型的多项指标并参与脑血管内皮细胞损伤状态的调整和恢复,而对于其康复与干预时间和疗程选择的相关性研究相对较少。本实验通过夹闭颈总动脉,建立局灶性脑缺血大鼠模型,并利用神经功能缺损评分验证模型成功与否。用ELISA法和免疫印迹法分析MMP-9在不同时间点的动态表达量变化及艾灸对其表达的影响,从而探讨艾灸在缺血脑组织保护方面的作用机制。

本实验结果显示,艾灸组大鼠在艾灸3d时,神经行为学评分尚无明显下降,随着艾灸天数增加,7d后的神经行为学评分明显低于模型组(P<0.05),提示艾灸类人迎穴可以改善脑缺血所引起的神经功能损伤。其机制可能艾灸使局部温度升高,舒张颈部血管,增加脑血流,从而改善脑缺血所致的神经功能损伤,这一结果与文献报道一致[13]

现代研究,MMP-9的升高与很多疾病相关,如心、脑血管病。在急性脑缺血时,此项指标显著升高[14],本实验结果与之相符。在不同时间点其升高的程度不同,本实验中模型组在脑缺血-再灌注损伤早期(6h),即有MMP-9明显增高(P<0.05),3d时最高,至7d时仍明显高于基础水平(P<0.05),表明MMP-9升高是脑缺血损伤后的早期反应,且MMP-9的升高能持续7d以上,与假手术组比较,有显著性差异。通过艾灸类人迎穴,可以降低脑缺血-再灌注大鼠血清和脑组织中MMP-9表达的峰值,与模型组相比,峰值低;艾灸7d时,MMP-9表达明显低于模型组,与基础值相当,有提前降至正常的趋势。有研究表明,MMP-9的升高可以加速神经元的损伤,破坏脑内血管内皮细胞,从而使脑缺血的损害性加重。艾灸能够降低MMP-9的含量,提示其有保护血管内皮细胞,抑制神经元损伤,控制病情的进一步发展。

本文还发现:艾灸可以促进伤口的愈合(如结痂时间)。艾灸组大鼠伤口结痂时间比模型组和假手术组均短,因为本实验造模后7d就处死大鼠,有的老鼠伤口还没有完全愈合,故未行统计。但是从整体上看,艾灸组伤口结痂时间比其他两组明显早,这与许多报道艾灸可以促进伤口愈合时间相一致[15-18]。艾灸可以加速创面修复组织中血管及血管内皮细胞的增殖,促进血管内皮生长因子[19](VEGF)的释放,使其表达高峰前移,从而促进皮肤创伤愈合。

综上,艾灸能够改善大鼠脑缺血所引起的神经功能缺损评分,减轻症状;降低脑缺血-再灌注大鼠血清和脑组织MMP-9表达的峰值,从而起到保护血管内皮细胞,抑制神经元损伤,控制病情的进一步发展;促进伤口的愈合。且艾灸方便易行,操作简便,疗效确切,无毒副作用,且费用低廉,值得进一步临床推广应用。

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