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  济宁医学院学报  2017, Vol. 40 Issue (6): 398-401, 406  DOI:10.3969/j.issn.1000-9760.2017.06.003
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李兆楼, 张波, 贾少辉, 刘莹, 徐香玉. 5-氟尿嘧啶分子与β-环糊精包合作用研究[J]. 济宁医学院学报, 2017, 40(6): 398-401, 406. DOI: 10.3969/j.issn.1000-9760.2017.06.003.
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LI Zhaolou, ZHANG Bo, JIA Shaohui, LIU Ying, XU Xiangyu. Formation of inclusion complexes of β-cyclodextrin with 5-fluorouracil in aqueous solution[J]. Journal Of Jining Medical University, 2017, 40(6): 398-401, 406. DOI: 10.3969/j.issn.1000-9760.2017.06.003.
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基金项目

济宁医学院博士科研启动基金项目(JY2015BS25);济宁市科技计划(医药卫生)项目(2015-53)

作者简介

刘莹,济宁医学院药学院2012级学生

文章历史

收稿日期:2017-10-09
5-氟尿嘧啶分子与β-环糊精包合作用研究
李兆楼1, 张波1, 贾少辉1, 刘莹2, 徐香玉3    
1. 济宁医学院基础医学院, 济宁 272067;
2. 济宁医学院 日照 276826;
3. 济宁医学院科研处, 济宁 272067
摘要: 目的 验证5-氟尿嘧啶分子与β-环糊精内包含作用,并测定其包合比、表观解离常数,提出包合物的可能结构。方法 用紫外分光光度法在极稀浓度下测定5-氟尿嘧啶的吸光度,考察不同β-环糊精浓度对5-氟尿嘧啶吸光度的影响;运用连续变量法及作图法求包合比和表观解离常数。结果 5-氟尿嘧啶的吸光度因β-环糊精浓度的增大而减小,确认β-环糊精对5-氟尿嘧啶分子发生包合作用;Job's plot表明:β-环糊精的摩尔分数为0.5时,β-环糊精对5-氟尿嘧啶的吸光度变化影响最大,说明二者包合摩尔比为1:1;包合物的表观解离常数为7.98×10-4结论 抗癌药物5-氟尿嘧啶分子能够全部包合在β-环糊精空腔之中,这揭示了两者构成的药物制剂的内部分子间的微结构关系。
关键词: 5-氟尿嘧啶    β-环糊精    包合比    连续变量法    
Formation of inclusion complexes of β-cyclodextrin with 5-fluorouracil in aqueous solution
LI Zhaolou1, ZHANG Bo1, JIA Shaohui1, LIU Ying2, XU Xiangyu3    
1. College of Basic Medicine, Jining Medical University, Jining 272067, China;
2. Jining Medical University, Rizhao 276826, China;
3. Research Department, Jining Medical University, Jining 272067, China
Abstract: Objective The purpose of this investigation is to explore the inclusion of β-cyclodextrin with 5-fluorouracil molecules.The apparent dissociation constant and the inclusion ratio of the β-cyclodextrin complexes are determined, and the structure of the inclusion complexes is speculated. Methods The absorbance of 5-fluorouracil was measured using UV spectrophotometry in extremely dilute solutions, and the absorption intensity change could suggest the generation of the β-cyclodextrin complexes.Utilizing the continuous variation method, the inclusion ratio and the apparent dissociation constant of the β-cyclodextrin complexes could be measured. Results The absorbance of 5-fluorouracil decreased with the increasing of concentration of β-cyclodextrin, suggesting the formation of β-cyclodextrin complexes.The maximal absorbance change of 5-fluorouracil was at the molar fraction of 0.5 in the job's plot, indicating the 1:1 inclusion ratio in inclusion complexes.The apparent dissociation constants of 7.98×10-4 was also calculated. Conclusion One molecule of 5-fluorouracil can entirely be contained into the β-cyclodextrin molecule cavity.This results reveal the microstructure of 5-fluorouracil with β-cyclodextrin molecule in their pharmaceutical preparation.
Key words: 5-Fluorouracil    β-Cyclodextrin    Inclusion ratio    Continuous variation Method    

5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-Fu)对许多肿瘤如结肠癌、直肠癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、皮肤癌等都具有一定疗效[1-3],故研究开发以β-环糊精(β-Cyclodextrin,β-CD)为辅料的5-Fu的药物制剂具有重要意义。β-CD的大环分子(图 1)能够使脂溶性药物的水溶性显著提高[4];尤其是所形成的β-CD包合物对抗癌药物分子具有控释与缓释作用,使其药物制剂相对于原料药具有更高的癌细胞抑制率[5]。因此,在分子水平上探讨5-Fu与β-CD分子之间的作用关系,对于研究药物制剂内部微结构以及药物制剂的性质、性能都具有一定的意义。研究β-CD与客体分子发生包合作用的物理方法较多,如荧光光谱、圆二色光谱、核磁共振波谱、电化学技术等,本文以紫外可见分光光度法为基础,运用连续变量法[6-8]进行研究。

图 1 5-氟尿嘧啶(a)和β-环糊精(b)的分子结构
1 实验部分 1.1 试剂与仪器

5-氟尿嘧啶(上海伊卡生物技术有限公司);β-环糊精(天津市光复精细化工研究所);紫外可见分光光度计(UV-2501PC,日本岛津)。

1.2 配制标准溶液

首先配制5-Fu的水溶液,再量取不同体积溶液放入各容量瓶中,配成一系列不同浓度的5-Fu标准溶液。

1.3 制备包合物

取一定量的5-Fu水溶液放入比色管中,然后再向其中加入一定量的β-CD水溶液,混合均匀后,于暗处充分反应24h,备用。

1.4 测定溶液吸光度

在UV-2501PC分光光度计上,选取265nm波长,测定待测液的吸光度,蒸馏水做参比溶液。

2 结果与讨论 2.1 标准曲线的绘制

表 1中5-Fu梯度浓度的顺序,用六支具塞试管取得C5-Fu的水溶液样品,选择波长265nm处,测取各试管中5-Fu的吸光度A值。见表 1

表 1 不同浓度的5-Fu水溶液对应的吸光度

把溶液浓度及其所对应平均吸光度进行回归分析,得到了回归方程A=0.7314C-0.01938,R2=0.9939,拟合回归方程得到标准曲线。见图 2

图 2 5-Fu的紫外吸收的标准曲线
2.2 包合物的形成

为了确定β-CD对5-Fu分子的包合作用,我们研究了不同浓度的β-CD影响下5-Fu的紫外吸收情况。保持5-Fu的浓度1.0×10-4mol L-1不变,分别加入不同量的β-CD形成一系列不同浓度的混合液(暗处保存24h),测定并对比265nm处的最大吸收情况, β-CD浓度与5-Fu(aq)的吸光度之间呈负相关,并有红移现象。因为β-CD在220nm以上没有紫外吸收,故得出结论:随着β-CD量的增大,5-Fu分子相当于经历一个从强极性水溶液到弱极性环境的转变,可归属为形成包合物造成的[9-10]。其间,5-Fu客体分子的疏水环结构完全进入β-CD分子疏水空腔,脱离了强极性水溶液环境,造成了被包合5-Fu分子内π-π*的跃迁强度降低[9]。由于5-Fu的分子几何形状和尺寸比较适合于β-CD分子空腔,其分子的环平面可以与β-CD分子圆锥体空腔的轴线平行,可以充分地被包容在β-CD分子空腔内。见图 3

图 3 不同浓度β-CD下5-Fu的紫外吸收图谱 注:1.无β-CD;2.5.0×10-6;3.5.0×10-5;4.1.0×10-4mol·L-1 β-CD
2.3 包合比的测定

图 3可知,我们拟用连续变量法[11-12]求得β-CD与5-Fu包合物的组成,即包合比。我们配制了一系列浓度的5-Fu水溶液,并测定其吸光度A0值(表 2);而后,在5-Fu水溶液中加入β-CD,且使β-CD摩尔分数呈单调递增,但两者的总浓度之和(即1.0 × 10-4mol·L-1)保持恒定;然后,测量其吸光度,得到一系列对应的A值(表 2);最后,以β-CD的摩尔分数Fβ-CD作横坐标,以A与A0之差(即ΔA)为纵坐标作图[11-12],拟合得等摩尔Job’s图。见图 4

表 2 5-Fu和β-CD等摩尔连续变量法有关吸光度及其改变量
图 4 β-CD在水溶液中包合5-Fu的等摩尔Job’s图

因为β-CD的包合作用会使5-Fu的吸光度减小,那么,图 4 ΔA最小值(即吸光度最大改变值)处就是两组分在反应量上实现了最恰当包合,则此处所对应的β-CD摩尔分数是0.5,说明包合物中β-CD和5-Fu二者组成比为1 :1。

2.4 包合物的表观解离常数

在连续变量法的基础上,我们可以根据Benesi-Hildebrand方程式[13]求算包合物的表观解离常数(Kd)或稳定常数(Kf),以评估5-Fu-β-CD包合物的稳定性。参照相关文献[9, 14],同样地可以建立关于5-Fu-β-CD包合物表观解离常数(Kd)的关系式(1):

$ \frac{{{A_0}}}{{A - {A_0}}} = \frac{{{\varepsilon _{5 - F{\rm{u}}}}}}{{{\varepsilon _{5 - Fu{\rm{ - }}\beta {\rm{ - }}CD}} - {\varepsilon _{5 - Fu}}}} + \frac{{{\varepsilon _{5 - F{\rm{u}}}}}}{{{\varepsilon _{5 - Fu{\rm{ - }}\beta {\rm{ - }}CD}} - {\varepsilon _{5 - Fu}}}} \times \frac{{{K_d}}}{{{C_{\beta {\rm{ - }}CD}}}} $ (1)

(1) 式中ε表示摩尔吸光系数。根据关系式(1)可知,以表 2中的有关数据为基础,可处理得到一系列(A0/A-A0)的绝对值和(1/Cβ-CD)对应的数据(表 3);若以1/Cβ-CD为横坐标,以A0/A-A0的绝对值为纵坐标作图,即得到一条直线(图 5)。该直线斜率为5.857×10-5、截距为0.073;该直线的斜率与截距二者比值即包合物表观解离常数(Kd=7.98×10-4)。从Kd值看出,5-Fu和β-CD二者能够存在包合与释放的平衡关系。

表 3 5-Fu和β-CD等摩尔连续变量法中(A0/A-A0)vs.(1/Cβ-CD)数据
图 5 等摩尔连续变量法(A0/A-A0)vs.(1/Cβ-CD)图
2.5 包合物的可能结构

我们(2.3中)已经求得,5-Fu-β-CD包合物组成比为1 :1。对于β-CD分子空腔来说,客体分子的形状、尺寸和极性匹配,是发生包合作用的必要条件[4, 15]。而这些条件对于5-Fu分子来说都已具备(2.2已述),其疏水性的分子环平面可以完全被包容在β-CD分子空腔内(图 6),与β-CD分子圆锥体的中轴线平行,确保它与β-CD分子疏水空腔最大程度的接触;再者,主客体之间的超分子作用如范德华力、氢键作用、偶极作用等也对包合物的结构和弱稳定性具有较大影响[4, 15]。5-Fu分子的两端的极性基团如羰基C=O、氟原子—F等,可能会与β-CD分子空腔外口部的羟基—OH等发生氢键作用和偶极作用等,这也一定程度上稳固了包合物的结构。见图 6

图 6 β-CD-5-Fu包合物的可能结构示意图
3 结论

研究表明,β-环糊精分子与抗癌药物5-氟尿嘧啶分子可以形成弱稳定性的包合物,该包合物中β-环糊精与5-氟尿嘧啶的组成摩尔比为1 :1,包合物的表观解离常数为7.98×10-4。这些结果为进一步研究β-环糊精为辅料的5-氟尿嘧啶新型药物制剂,提供了其内部微结构和分子间作用的依据;同时也表明,β-环糊精分子空腔对5-氟尿嘧啶分子存在着包合的缓释作用。

参考文献
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