2. 济宁医学院 日照 276826;
3. 济宁医学院科研处, 济宁 272067
2. Jining Medical University, Rizhao 276826, China;
3. Research Department, Jining Medical University, Jining 272067, China
5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-Fu)对许多肿瘤如结肠癌、直肠癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、皮肤癌等都具有一定疗效[1-3],故研究开发以β-环糊精(β-Cyclodextrin,β-CD)为辅料的5-Fu的药物制剂具有重要意义。β-CD的大环分子(图 1)能够使脂溶性药物的水溶性显著提高[4];尤其是所形成的β-CD包合物对抗癌药物分子具有控释与缓释作用,使其药物制剂相对于原料药具有更高的癌细胞抑制率[5]。因此,在分子水平上探讨5-Fu与β-CD分子之间的作用关系,对于研究药物制剂内部微结构以及药物制剂的性质、性能都具有一定的意义。研究β-CD与客体分子发生包合作用的物理方法较多,如荧光光谱、圆二色光谱、核磁共振波谱、电化学技术等,本文以紫外可见分光光度法为基础,运用连续变量法[6-8]进行研究。
5-氟尿嘧啶(上海伊卡生物技术有限公司);β-环糊精(天津市光复精细化工研究所);紫外可见分光光度计(UV-2501PC,日本岛津)。
1.2 配制标准溶液首先配制5-Fu的水溶液,再量取不同体积溶液放入各容量瓶中,配成一系列不同浓度的5-Fu标准溶液。
1.3 制备包合物取一定量的5-Fu水溶液放入比色管中,然后再向其中加入一定量的β-CD水溶液,混合均匀后,于暗处充分反应24h,备用。
1.4 测定溶液吸光度在UV-2501PC分光光度计上,选取265nm波长,测定待测液的吸光度,蒸馏水做参比溶液。
2 结果与讨论 2.1 标准曲线的绘制按表 1中5-Fu梯度浓度的顺序,用六支具塞试管取得C5-Fu的水溶液样品,选择波长265nm处,测取各试管中5-Fu的吸光度A值。见表 1。
把溶液浓度及其所对应平均吸光度进行回归分析,得到了回归方程A=0.7314C-0.01938,R2=0.9939,拟合回归方程得到标准曲线。见图 2。
为了确定β-CD对5-Fu分子的包合作用,我们研究了不同浓度的β-CD影响下5-Fu的紫外吸收情况。保持5-Fu的浓度1.0×10-4mol L-1不变,分别加入不同量的β-CD形成一系列不同浓度的混合液(暗处保存24h),测定并对比265nm处的最大吸收情况, β-CD浓度与5-Fu(aq)的吸光度之间呈负相关,并有红移现象。因为β-CD在220nm以上没有紫外吸收,故得出结论:随着β-CD量的增大,5-Fu分子相当于经历一个从强极性水溶液到弱极性环境的转变,可归属为形成包合物造成的[9-10]。其间,5-Fu客体分子的疏水环结构完全进入β-CD分子疏水空腔,脱离了强极性水溶液环境,造成了被包合5-Fu分子内π-π*的跃迁强度降低[9]。由于5-Fu的分子几何形状和尺寸比较适合于β-CD分子空腔,其分子的环平面可以与β-CD分子圆锥体空腔的轴线平行,可以充分地被包容在β-CD分子空腔内。见图 3。
由图 3可知,我们拟用连续变量法[11-12]求得β-CD与5-Fu包合物的组成,即包合比。我们配制了一系列浓度的5-Fu水溶液,并测定其吸光度A0值(表 2);而后,在5-Fu水溶液中加入β-CD,且使β-CD摩尔分数呈单调递增,但两者的总浓度之和(即1.0 × 10-4mol·L-1)保持恒定;然后,测量其吸光度,得到一系列对应的A值(表 2);最后,以β-CD的摩尔分数Fβ-CD作横坐标,以A与A0之差(即ΔA)为纵坐标作图[11-12],拟合得等摩尔Job’s图。见图 4。
因为β-CD的包合作用会使5-Fu的吸光度减小,那么,图 4 ΔA最小值(即吸光度最大改变值)处就是两组分在反应量上实现了最恰当包合,则此处所对应的β-CD摩尔分数是0.5,说明包合物中β-CD和5-Fu二者组成比为1 :1。
2.4 包合物的表观解离常数在连续变量法的基础上,我们可以根据Benesi-Hildebrand方程式[13]求算包合物的表观解离常数(Kd)或稳定常数(Kf),以评估5-Fu-β-CD包合物的稳定性。参照相关文献[9, 14],同样地可以建立关于5-Fu-β-CD包合物表观解离常数(Kd)的关系式(1):
$ \frac{{{A_0}}}{{A - {A_0}}} = \frac{{{\varepsilon _{5 - F{\rm{u}}}}}}{{{\varepsilon _{5 - Fu{\rm{ - }}\beta {\rm{ - }}CD}} - {\varepsilon _{5 - Fu}}}} + \frac{{{\varepsilon _{5 - F{\rm{u}}}}}}{{{\varepsilon _{5 - Fu{\rm{ - }}\beta {\rm{ - }}CD}} - {\varepsilon _{5 - Fu}}}} \times \frac{{{K_d}}}{{{C_{\beta {\rm{ - }}CD}}}} $ | (1) |
(1) 式中ε表示摩尔吸光系数。根据关系式(1)可知,以表 2中的有关数据为基础,可处理得到一系列(A0/A-A0)的绝对值和(1/Cβ-CD)对应的数据(表 3);若以1/Cβ-CD为横坐标,以A0/A-A0的绝对值为纵坐标作图,即得到一条直线(图 5)。该直线斜率为5.857×10-5、截距为0.073;该直线的斜率与截距二者比值即包合物表观解离常数(Kd=7.98×10-4)。从Kd值看出,5-Fu和β-CD二者能够存在包合与释放的平衡关系。
我们(2.3中)已经求得,5-Fu-β-CD包合物组成比为1 :1。对于β-CD分子空腔来说,客体分子的形状、尺寸和极性匹配,是发生包合作用的必要条件[4, 15]。而这些条件对于5-Fu分子来说都已具备(2.2已述),其疏水性的分子环平面可以完全被包容在β-CD分子空腔内(图 6),与β-CD分子圆锥体的中轴线平行,确保它与β-CD分子疏水空腔最大程度的接触;再者,主客体之间的超分子作用如范德华力、氢键作用、偶极作用等也对包合物的结构和弱稳定性具有较大影响[4, 15]。5-Fu分子的两端的极性基团如羰基C=O、氟原子—F等,可能会与β-CD分子空腔外口部的羟基—OH等发生氢键作用和偶极作用等,这也一定程度上稳固了包合物的结构。见图 6。
研究表明,β-环糊精分子与抗癌药物5-氟尿嘧啶分子可以形成弱稳定性的包合物,该包合物中β-环糊精与5-氟尿嘧啶的组成摩尔比为1 :1,包合物的表观解离常数为7.98×10-4。这些结果为进一步研究β-环糊精为辅料的5-氟尿嘧啶新型药物制剂,提供了其内部微结构和分子间作用的依据;同时也表明,β-环糊精分子空腔对5-氟尿嘧啶分子存在着包合的缓释作用。
[1] | 张红雨, 赵春临, 叶延伟. 氟尿嘧啶血药浓度监测对于结直肠癌患者化疗疗效的研究进展[J]. 河南医学研究, 2016, 25(2): 260–262. DOI:10.3969/j.issn.1004-437X.2016.02.032 |
[2] | 郝永胜, 李凤晓, 范伟. 进展期胃癌术中植入5-氟尿嘧啶缓释剂的疗效观察[J]. 中国药物与临床, 2016, 16(4): 558–560. DOI:10.11655/zgywylc2016.04.042 |
[3] | 李雅, 王晓梅, 韩士田, 等. 5-氟尿嘧啶衍生物的抗癌活性研究[J]. 河北工程大学学报(自然科学版), 2008, 25(1): 92–95. DOI:10.3969/j.issn.1673-9469.2008.01.025 |
[4] | 童林荟. 环糊精化学:基础与应用[M]. 北京: 科学出版社, 2001: 373-377. |
[5] | Sun T, Guo Q, Zhang C, et al. Self-assembled vesicles prepared from amphiphilic cyclodextrins as drug carriers[J]. Langmuir, 2012, 28(23): 8625–8636. DOI:10.1021/la301497t |
[6] | Gil V MS, Oliveira NC. On the use of the method of continuous variations[J]. Journal of Chemical Education, 1990, 67(6): 473. DOI:10.1021/ed067p473 |
[7] | Renny JS, Tomasevich LL, Tallmadge EH, et al. Method of continuous variations:applications of job plots to the study of molecular associations in organometallic chemistry[J]. Angew Chem Int Ed Engl, 2013, 52(46): 11998–12013. DOI:10.1002/anie.201304157 |
[8] | MacCarthy P. Simplified experimental route for obtaining Job's curves[J]. Analytical Chemistry, 1978, 50(14): 2165–2165. DOI:10.1021/ac50036a059 |
[9] | Dang XJ, Nie MY, Tong J, et al. Inclusion of the parent molecules of some drugs with β-cyclodextrin studied by electrochemical and spectrometric methods[J]. Journal of Electroanalytical Chemistry, 1998, 448(1): 61–67. DOI:10.1016/s0022-0728(97)00516-0 |
[10] | Smith VK, Ndou TT, WarnerI M. Spectroscopic Study of the Interaction of Catechin with.alpha.-, .beta.-, and.gamma.-Cyclodextrins[J]. The Journal of Physical Chemistry, 1994, 98(35): 8627–8631. DOI:10.1021/j100086a007 |
[11] | Song LX, Wang HM, Guo XQ, et al. A comparative study on the binding behaviors of beta-cyclodextrin and its two derivatives to four fanlike organic guests[J]. J Org Chem, 2008, 73(21): 8305–8316. DOI:10.1021/jo801436h |
[12] | Singh AP, Cabrer PR, Alvarez-Parrilla E, et al. Complexation of 6-deoxy-6-(aminoethy)amino-β-cyclodextrin with sodium cholate and sodium deoxycholate[J]. Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry, 1999, 35: 335–348. DOI:10.1023/A:100816752054 |
[13] | Benesi HA, Hildebrand JH. A Spectrophotometric investigation of the interaction of iodine with aromatic hydrocarbons[J]. Journal of the American Chemical Society, 1949, 71(8): 2703–2707. DOI:10.1021/ja01176a030 |
[14] | Dang XJ, Tong R, Li HL. The electrochemistry of the inclusion complex of anthraquinone with β-cyclodextrin studied by means of OSWV[J]. Journal of Inclusion Phenomena and Molecular Recognition in Chemistry, 1996, 24(4): 275–286. DOI:10.1007/bf01041113 |
[15] | Hapiot F, Tilloy S, Monflier E. Cyclodextrins as supramolecular hosts for organometallic complexes[J]. Chem Rev, 2006, 106(3): 767–781. DOI:10.1021/cr050576c |