2. 青岛医保城药品连锁有限公司, 青岛 266199;
3. 济宁医学院药学院, 日照 276826
2. Qingdao Medical Insurance City Pharmaceutical Group Limited, Qingdao 266199, China;
3. College of Pharmacy, Jining Medical University, Rizhao 276826, China
传统的化学药物治疗会产生很多无法耐受的不良反应。因此在使用传统的化疗药物进行治疗的同时,如何减轻癌症患者的痛苦,提高生存质量,成为一个亟待解决的问题。使用具有免疫保护力的天然药物来预防及治疗癌症,既可减轻传统化疗药物的毒副作用,同时又保护和提高患者的自身免疫力。西兰花是十字花科植物—甘蓝种的一个变种,又名青菜花或木兰花椰菜或绿菜花或意大利芥蓝,具有极高的营养价值,被誉为“蔬菜皇冠”[1]。在西兰花中最著名的化学预防成分为萝卜硫素(sulforaphane, SF), 它是由硫苷经植物体内的苷酶水解产生,也可以在生物体内由肠道菌群水解而产生[2]。SF现已成为公认的植物当中活性最强的抗癌成分之一[3-5]。近年来,国内外学者更多的研究主要面向于西兰花有效成分的提取以及SF抗肿瘤方面的研究,而缺乏对其免疫调节方面深入、全面的探讨。因此,本实验研究西兰花提取物SF对机体多方面免疫功能的影响,观察其对环磷酰胺(Cy)所导致免疫抑制小鼠的迟发型超敏反应(DTH反应)及IL-10、TNF-α表达的影响,探讨SF在细胞因子水平免疫调节作用及其机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 动物4~8周龄ICR小鼠〔购自郑州市华兴实验动物养殖场,生产证号号:SCX(鄂)2016-0007〕,体重19~22g,雌雄各半。
1.1.2 实验仪器酶联免疫检测仪(赛默飞世尔(上海)仪器有限公司);离心机(LD5-2A型, 湘潭离心机有限公司);凝胶图像分析系统(北京麦思奇MSD-2000A)。
1.1.3 实验用试剂SF(购自Aladdin试剂公司, 货号:S111997);Cy(购自江苏恒瑞医药股份有限公司, 货号:H32020857);1%二硝基氟苯(DNFB);IL-10、TNF-α检测试剂盒(晶美生物工程有限公司)。
1.2 实验方法 1.2.1 试验动物分组及给药ICR小鼠随机分为正常对照组、Cy模型组、SF高剂量组以及SF低剂量组,每组10只。实验开始前,正常饲喂3d,除正常对照组以外,其余3组均在实验的第3天注射Cy(80mg/kg)进行免疫抑制,正常对照组注射等量的生理盐水。实验第1天开始,SF高、低剂量组需每日灌胃高、低剂量的SF,共10d,其余两组灌胃等体积的生理盐水。
1.2.2 小鼠胸腺(脾脏)指数测定最后一次给药2h后,称重,做好标记,小鼠脱颈椎处死,无菌解剖条件下取其胸腺及脾脏,使用精密天平称量重量并记录。计算公式:胸腺(脾脏)指数=胸腺(脾脏)质量(mg)/体重(g)。
1.2.3 小鼠血清溶血素测定实验开始第6天,每组小鼠腹腔注射10%的绵羊红细胞,每鼠0.2ml, 且在最后一次给药2h后,用眼科镊眼眶取血2ml, 室温放置30min,2000r/min, 离10min, 取上清,用PBS将上述血清分别做1 :25、1 :100、1 :500、1 :1000、1 :2000、1 :3200递减稀释,取稀释后的血清0.1ml置于酶标板中,然后加入等量的0.2%的SRBC和豚鼠血清(1 :20),实验均做4个复孔,且分别设置血清对照、绵羊红细胞对照、豚鼠血清对照以及PBS空白对照,快速放置于37℃水浴箱中温浴时间60min后,2000r/min, 10min。最后取上清150μl, 放置于一个新的酶标板中,在450nm下,用酶标仪测定OD值。
1.2.4 小鼠迟发型超敏反应检测实验第2天,用肥皂水涂湿每组小鼠的腹部,然后用手术刀轻轻刮去小鼠腹部的毛发。面积大约为3cm×3cm, 待腹部变干后,向去毛部位涂抹50μl的1%的DNFB,次日再强化1次,在实验的最后一天,在小鼠的右耳部位涂抹10μl的0.2%的DNFB,以便给小鼠充分的攻击,最后一次给药24h后,将小鼠脱颈处死,用打孔器将其左右耳取下,用精密电子天平分别称取小鼠左右耳的重量,左右耳的重量之差代表小鼠耳朵的肿胀度。
1.2.5 ELISA法测定小鼠外周血的TNF-α及IL-10因子的表达最后一次给药2h后,每组小鼠眼眶取血。室温下静置30min,然后2000r/min, 离心10min, 取上清,依照ELISA试剂盒说明书进行操作。酶标仪在450nm条件分别测定IL-10及TNF-a的OD值,由标准品OD值和空白组的OD值得到实际标准品OD值,根据ELISA试剂盒上的标准品浓度,以OD值作纵坐标,标准品浓度为横坐标,绘制出标准曲线,根据实际样本的OD值分别计算出两者的实际浓度。
1.2.6 RT-PCR检测小鼠脾脏TNF-α及IL-10mRNA的表达采用匀浆法收集脾细胞,TrizolRNA提取小鼠脾细胞总RNA,逆转录为c DNA。半定量RT-PCR法检测小鼠脾脏TNF-α及IL-10mRNA的表达。TNF-α引物(209 bp)上游5′-ACCGTCAGCCGATTTGCTAT-3′,下游5′-CCGGACT CCGCAAAGTCTAA-3′;IL-10引物(489bp)上游5′-AGGCGCTGTCATCGATTTCT-3′,下游5′-AGGAAG AACCCCTCCCATCA-3′。采用GAPDH(183bp)作为内参,序列:上游5′-ATTCAACGGCACAGTCAAGG-3′, 下游5′-GCAGAAGGGGCCGGAGATGA-3′。PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,凝胶扫描分析DNA电泳条带光量子强度,以目的DNA电泳条带光量子强度与GADPH电泳条带光量子强度比值为其表达水平的参数。
1.3 统计学方法实验数据用SPSS18.0统计软件进行分析。计量单位以x±s表示,采用方差分析进行多组间比较,采用SNK-q检验进一步两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 SF对各组小鼠胸腺(脾脏)指数的影响与正常对照组相比,Cy模型组胸腺(脾脏)的指数明显缩小(P<0.05),建模成功。与Cy模型组相比,SF高、低剂量组的胸腺(脾脏)指数显著增大(P<0.05)。见表 1。
与正常对照组比较,Cy模型组的OD值显著低于正常对照组(P<0.05),SF高、低剂量组的OD值均明显高于Cy模型组(P<0.05),说明SF能够增加小鼠的血清溶血素的含量,提高小鼠抗体生成率。见表 2。
与正常对照组相比,Cy模型组的小鼠耳廓的肿胀度要明显变小(P<0.05),说明本实验造模成功,而SF高、低剂量组与Cy模型组相比显著增大, 说明SF高、低剂量组对Cy抑制的小鼠DTH均有拮抗作用,在此实验中高、低剂量的SF均增强免疫低下小鼠的DTH反应,增强机体细胞免疫能力。见表 3。
与正常对照组相比,Cy模型组的TNF-a的表达水平明显降低(P<0.05), 而SF高、低剂量组的TNF-α的表达水平相对于Cy模型组均显著增加(P<0.05), 说明SF显著提高小鼠TNF-α的表达水平,且SF高剂量组效果更好。见表 4。
与正常对照组相比,Cy模型组小鼠外周血IL-10的表达水平明显升高(P<0.05),作为免疫抑制性细胞因子,IL-10表达水平的升高说明造模成功。与Cy组相比,SF低剂量组的IL-10的表达水平却明显降低(P<0.05), 且与低剂量组相比,SF高剂量组降低的更加明显(P<0.05),由此说明,SF高剂量组、SF低剂量组对Cy所致的免疫低下小鼠均具有很好的免疫保护作用,且SF高剂量组优于SF低剂量组。见表 5。
与正常对照组相比,Cy模型组IL-10 mRNA表达显著增加,TNF-α mRNA表达显著降低(P<0.05)。而SF高、低剂量组与Cy模型组IL-10 mRNA, 表达显著降低TNF-α mRNA表达显著增加,(P<0.05)。这与脾脏细胞ELISA检测结果一致。见图 1、表 6、表 7。
本实验利用Cy对ICR小鼠进行造模[6-9],以破坏小鼠的免疫功能,然后在此基础上给予不同剂量的SF,以考察SF对于免疫低下小鼠的免疫调节作用。胸腺和脾脏是机体极为重要的免疫器官,且当机体的免疫力升高时,二者的质量也会增大,而当免疫低下时,则与之相反。因此,本实验首先观察小鼠胸腺、脾脏指数的变化。本文结果显示,SF高、低剂量组的胸腺(脾脏)指数均高于Cy模型组,说明SF对Cy致免疫抑制小鼠的免疫器官具有很好的保护作用。其次测定血清溶血素水平实验以检测小鼠体液免疫水平的改变,结果显示,SF高、低剂量组均能显著提高小鼠血清抗体生成率,增强机体的体液免疫应答水平。而对于DTH来讲,其反应强度是机体的淋巴细胞参与的结果。当机体的免疫功能较高时,可以增强DTH反应,则左右耳之差(即肿胀度)随之也会变大。小鼠DTH检测发现,SF高、低剂量组的肿胀度要高于Cy模型组,且剂量越高肿胀度越大。SF可明显增强免疫低下小鼠的DTH反应,表明其可大大增强Th1细胞免疫功能。上述实验结果表明,无论从体液免疫还是细胞免疫,SF均显示出很好的免疫增强活性,是一种非常好的免疫保护剂。
TNF-α是由体内单核巨噬细胞、肥大细胞合成和分泌的一种细胞因子,具有广泛的生物学活性,在杀伤靶细胞、促进炎症反应及免疫调节等多方面发挥重要作用。其在机体内的含量与机体的免疫功能状态呈正相关。本文结果显示SF高、低剂量组的小鼠TNF-α外周血的表达及免疫器官mRNA的表达水平相对于Cy模型组明显升高,则说明SF提升机体整体的免疫功能,刺激活化的巨噬细胞释放TNF-α,TNF-α的水平增加,提升机体免疫力。
IL-10多由体内Th2细胞和巨噬细胞产生,对单核巨噬细胞、NK细胞、Th2细胞均有一定的抑制活性[12-13]。与TNF-α相反,IL-10是一种免疫抑制剂,它的表达水平与机体的免疫功能呈负相关,当机体的免疫功能增强时,IL-10的表达水平将会降低,反之,当机体的免疫功能下降时,IL-10的表达水平就会升高。本文结果显示,无论是外周血细胞因子的表达,还是脾细胞mRNA的表达,均显示Cy模型组的IL-10表达水平均高于SF高、低剂量组。由此,SF可促使IL-10表达下降,提高了机体Th2细胞亚群分化和成熟,提高机体免疫力。外周血中IL-10和TNF-α因子的分泌水平的测定,让我们进一步观察研究了SF对机体的免疫增强作用的具体调节机制。上述结果与我们前期的实验结果保持一致[14],再次证明SF对机体具有良好的免疫保护作用。从而为SF在免疫保护和调节方面提供更多的更为全面的研究资料,进一步为SF在癌症的预防和治疗、提高机体免疫力等多方面提供有效的参考。
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