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  济宁医学院学报  2017, Vol. 40 Issue (6): 393-397  DOI:10.3969/j.issn.1000-9760.2017.06.002
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李臻, 信珊珊, 董晓磊, 王北, 高慧婕, 刘超. 萝卜硫素对免疫抑制小鼠免疫功能的影响[J]. 济宁医学院学报, 2017, 40(6): 393-397. DOI: 10.3969/j.issn.1000-9760.2017.06.002.
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LI Zhen, XIN Shanshan, DONG Xiaolei, WANG Bei, GAO Huijie, LIU Chao. The immunoregulation effect of sulforaphane in immunosuppressed mice[J]. Journal Of Jining Medical University, 2017, 40(6): 393-397. DOI: 10.3969/j.issn.1000-9760.2017.06.002.
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基金项目

济宁医学院大学生创新计划项目(cx2016029);济宁市科技发展计划项目(2015-57-114);济宁医学院博士科研基金项目(JY2015BS23)

通信作者

刘超, E-mail:mianyigao@163.com;

文章历史

收稿日期:2017-11-09
萝卜硫素对免疫抑制小鼠免疫功能的影响
李臻1, 信珊珊2, 董晓磊1, 王北1, 高慧婕3, 刘超3    
1. 济宁医学院生物科学学院, 日照 276826;
2. 青岛医保城药品连锁有限公司, 青岛 266199;
3. 济宁医学院药学院, 日照 276826
摘要: 目的 观察萝卜硫素(SF)对环磷酰胺(Cy)所致免疫抑制小鼠的迟发性超敏反应及IL-10及TNF-α表达的影响,探讨SF对机体免疫系统的调节机制。方法 ICR小鼠随机分4组:正常对照组、Cy模型组、SF高剂量组(50mg/kg)、SF低剂量组(25mg/kg),每组10只。采取灌胃给药法。实验10d后,检测小鼠胸腺(脾脏)指数、小鼠血清溶血素的浓度;DNFB致敏观察小鼠迟发型超敏反应(DTH反应);ELISA测定外周血脾脏细胞白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-a(TNF-α)的表达水平;RT-PCR检测小鼠细胞IL-10、TNF-α mRNA的表达水平。结果 相对于Cy模型组,SF高、低剂量组胸腺指数、脾脏指数以及小鼠耳廓的肿胀度增大,血清溶血素水平升高,外周血TNF-α的表达升高,IL-10的表达降低,差异具有统计学意义(P < 0.05);与Cy模型组相比,SF高、低剂量组的脾脏细胞TNF-α mRNA表达升高,IL-10mRNA表达降低,差异具有统计学意义(P < 0.05)。结论 SF对Cy所致的免疫低下小鼠有较强的免疫保护作用,可能通过促进TNF-α的分泌上调免疫功能,或通过抑制IL-10的表达降低机体的免疫负调节。
关键词: 萝卜硫素    DTH    IL-10    TNF-α    
The immunoregulation effect of sulforaphane in immunosuppressed mice
LI Zhen1, XIN Shanshan2, DONG Xiaolei1, WANG Bei1, GAO Huijie3, LIU Chao3    
1. College of Biological Sciences, Jining Medical University, Rizhao 276826, China;
2. Qingdao Medical Insurance City Pharmaceutical Group Limited, Qingdao 266199, China;
3. College of Pharmacy, Jining Medical University, Rizhao 276826, China
Abstract: Objective To study the immunoregulation effect of Sulforaphane by observing its effect on IL-10, TNF-α expressions and the delayed type hypersensitivity(DTH) in cyclophosphamide induced immunosuppressed mice. Methods The ICR mice were divided into four groups randomly(10 mice in each group):control group, cyclophosphamide (Cy) group, Sulforaphane high-dose group(50mg/kg) and Sulforaphane low-dose group(25mg/kg).The intragastric administration was used, and the thymus and spleen index, the content of serum hemolysin, the DTH reaction, the expression of Interleukin (IL-10) and Tumor necrosis factor (TNF-α) was analyzed after 10 days. Results Compared with Cy model group, Sulforaphane high-dose and low-dose groups increased the number of spleen index, thymus index, hemolysin OD value and the TNF-α concentration.the expression of TNF-α mRNA, and decreased the IL-10 concentration, the expression of IL-10 mRNA (P < 0.05). Conclusion Sulforaphane can notably improve the immune function in immune-suppressive mice by increasing the expression of TNF-α or decreasing the expression of IL-10.
Key words: Sulforaphane(SF)    DTH (delayed type hypersensitivity)    IL-10    TNF-α    

传统的化学药物治疗会产生很多无法耐受的不良反应。因此在使用传统的化疗药物进行治疗的同时,如何减轻癌症患者的痛苦,提高生存质量,成为一个亟待解决的问题。使用具有免疫保护力的天然药物来预防及治疗癌症,既可减轻传统化疗药物的毒副作用,同时又保护和提高患者的自身免疫力。西兰花是十字花科植物—甘蓝种的一个变种,又名青菜花或木兰花椰菜或绿菜花或意大利芥蓝,具有极高的营养价值,被誉为“蔬菜皇冠”[1]。在西兰花中最著名的化学预防成分为萝卜硫素(sulforaphane, SF), 它是由硫苷经植物体内的苷酶水解产生,也可以在生物体内由肠道菌群水解而产生[2]。SF现已成为公认的植物当中活性最强的抗癌成分之一[3-5]。近年来,国内外学者更多的研究主要面向于西兰花有效成分的提取以及SF抗肿瘤方面的研究,而缺乏对其免疫调节方面深入、全面的探讨。因此,本实验研究西兰花提取物SF对机体多方面免疫功能的影响,观察其对环磷酰胺(Cy)所导致免疫抑制小鼠的迟发型超敏反应(DTH反应)及IL-10、TNF-α表达的影响,探讨SF在细胞因子水平免疫调节作用及其机制。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 动物

4~8周龄ICR小鼠〔购自郑州市华兴实验动物养殖场,生产证号号:SCX(鄂)2016-0007〕,体重19~22g,雌雄各半。

1.1.2 实验仪器

酶联免疫检测仪(赛默飞世尔(上海)仪器有限公司);离心机(LD5-2A型, 湘潭离心机有限公司);凝胶图像分析系统(北京麦思奇MSD-2000A)。

1.1.3 实验用试剂

SF(购自Aladdin试剂公司, 货号:S111997);Cy(购自江苏恒瑞医药股份有限公司, 货号:H32020857);1%二硝基氟苯(DNFB);IL-10、TNF-α检测试剂盒(晶美生物工程有限公司)。

1.2 实验方法 1.2.1 试验动物分组及给药

ICR小鼠随机分为正常对照组、Cy模型组、SF高剂量组以及SF低剂量组,每组10只。实验开始前,正常饲喂3d,除正常对照组以外,其余3组均在实验的第3天注射Cy(80mg/kg)进行免疫抑制,正常对照组注射等量的生理盐水。实验第1天开始,SF高、低剂量组需每日灌胃高、低剂量的SF,共10d,其余两组灌胃等体积的生理盐水。

1.2.2 小鼠胸腺(脾脏)指数测定

最后一次给药2h后,称重,做好标记,小鼠脱颈椎处死,无菌解剖条件下取其胸腺及脾脏,使用精密天平称量重量并记录。计算公式:胸腺(脾脏)指数=胸腺(脾脏)质量(mg)/体重(g)。

1.2.3 小鼠血清溶血素测定

实验开始第6天,每组小鼠腹腔注射10%的绵羊红细胞,每鼠0.2ml, 且在最后一次给药2h后,用眼科镊眼眶取血2ml, 室温放置30min,2000r/min, 离10min, 取上清,用PBS将上述血清分别做1 :25、1 :100、1 :500、1 :1000、1 :2000、1 :3200递减稀释,取稀释后的血清0.1ml置于酶标板中,然后加入等量的0.2%的SRBC和豚鼠血清(1 :20),实验均做4个复孔,且分别设置血清对照、绵羊红细胞对照、豚鼠血清对照以及PBS空白对照,快速放置于37℃水浴箱中温浴时间60min后,2000r/min, 10min。最后取上清150μl, 放置于一个新的酶标板中,在450nm下,用酶标仪测定OD值。

1.2.4 小鼠迟发型超敏反应检测

实验第2天,用肥皂水涂湿每组小鼠的腹部,然后用手术刀轻轻刮去小鼠腹部的毛发。面积大约为3cm×3cm, 待腹部变干后,向去毛部位涂抹50μl的1%的DNFB,次日再强化1次,在实验的最后一天,在小鼠的右耳部位涂抹10μl的0.2%的DNFB,以便给小鼠充分的攻击,最后一次给药24h后,将小鼠脱颈处死,用打孔器将其左右耳取下,用精密电子天平分别称取小鼠左右耳的重量,左右耳的重量之差代表小鼠耳朵的肿胀度。

1.2.5 ELISA法测定小鼠外周血的TNF-α及IL-10因子的表达

最后一次给药2h后,每组小鼠眼眶取血。室温下静置30min,然后2000r/min, 离心10min, 取上清,依照ELISA试剂盒说明书进行操作。酶标仪在450nm条件分别测定IL-10及TNF-a的OD值,由标准品OD值和空白组的OD值得到实际标准品OD值,根据ELISA试剂盒上的标准品浓度,以OD值作纵坐标,标准品浓度为横坐标,绘制出标准曲线,根据实际样本的OD值分别计算出两者的实际浓度。

1.2.6 RT-PCR检测小鼠脾脏TNF-α及IL-10mRNA的表达

采用匀浆法收集脾细胞,TrizolRNA提取小鼠脾细胞总RNA,逆转录为c DNA。半定量RT-PCR法检测小鼠脾脏TNF-α及IL-10mRNA的表达。TNF-α引物(209 bp)上游5′-ACCGTCAGCCGATTTGCTAT-3′,下游5′-CCGGACT CCGCAAAGTCTAA-3′;IL-10引物(489bp)上游5′-AGGCGCTGTCATCGATTTCT-3′,下游5′-AGGAAG AACCCCTCCCATCA-3′。采用GAPDH(183bp)作为内参,序列:上游5′-ATTCAACGGCACAGTCAAGG-3′, 下游5′-GCAGAAGGGGCCGGAGATGA-3′。PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,凝胶扫描分析DNA电泳条带光量子强度,以目的DNA电泳条带光量子强度与GADPH电泳条带光量子强度比值为其表达水平的参数。

1.3 统计学方法

实验数据用SPSS18.0统计软件进行分析。计量单位以x±s表示,采用方差分析进行多组间比较,采用SNK-q检验进一步两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 SF对各组小鼠胸腺(脾脏)指数的影响

与正常对照组相比,Cy模型组胸腺(脾脏)的指数明显缩小(P<0.05),建模成功。与Cy模型组相比,SF高、低剂量组的胸腺(脾脏)指数显著增大(P<0.05)。见表 1

表 1 4组小鼠胸腺指数与脾指数的比较(n=10, x±s)
2.2 SF对各组小鼠血清溶血素的影响

与正常对照组比较,Cy模型组的OD值显著低于正常对照组(P<0.05),SF高、低剂量组的OD值均明显高于Cy模型组(P<0.05),说明SF能够增加小鼠的血清溶血素的含量,提高小鼠抗体生成率。见表 2

表 2 4组小鼠血清溶血功能的比较(n=10, x±s)
2.3 SF对各组小鼠DTH的影响

与正常对照组相比,Cy模型组的小鼠耳廓的肿胀度要明显变小(P<0.05),说明本实验造模成功,而SF高、低剂量组与Cy模型组相比显著增大, 说明SF高、低剂量组对Cy抑制的小鼠DTH均有拮抗作用,在此实验中高、低剂量的SF均增强免疫低下小鼠的DTH反应,增强机体细胞免疫能力。见表 3

表 3 4组小鼠DTH的比较(n=10, x±s)
2.4 SF对各组小鼠外周血TNF-α和IL-10表达的影响 2.4.1 SF对小鼠外周血TNF-α表达的影响

与正常对照组相比,Cy模型组的TNF-a的表达水平明显降低(P<0.05), 而SF高、低剂量组的TNF-α的表达水平相对于Cy模型组均显著增加(P<0.05), 说明SF显著提高小鼠TNF-α的表达水平,且SF高剂量组效果更好。见表 4

表 4 4组小鼠TNF-α的比较(n=10, x±s)
2.4.2 SF对小鼠外周血IL-10表达的影响

与正常对照组相比,Cy模型组小鼠外周血IL-10的表达水平明显升高(P<0.05),作为免疫抑制性细胞因子,IL-10表达水平的升高说明造模成功。与Cy组相比,SF低剂量组的IL-10的表达水平却明显降低(P<0.05), 且与低剂量组相比,SF高剂量组降低的更加明显(P<0.05),由此说明,SF高剂量组、SF低剂量组对Cy所致的免疫低下小鼠均具有很好的免疫保护作用,且SF高剂量组优于SF低剂量组。见表 5

表 5 4组小鼠IL-10表达的比较(n=10, x±s)
2.5 SF对各组小鼠脾脏细胞TNF-α和IL-10 mRNA表达的影响

与正常对照组相比,Cy模型组IL-10 mRNA表达显著增加,TNF-α mRNA表达显著降低(P<0.05)。而SF高、低剂量组与Cy模型组IL-10 mRNA, 表达显著降低TNF-α mRNA表达显著增加,(P<0.05)。这与脾脏细胞ELISA检测结果一致。见图 1表 6表 7

图 1 RT-PCR测定TNF-α mRNA和IL-10 mRNA的表达 注:M.Marker; a.Cy模型组组; b.SF高剂量组;
c.SF低剂量组d.正常对照组
A.IL-10mRNA; B.TNF-α mRNA; C.GADPH mRNA
表 6 4组小鼠血清IL-10的比较(n=10, x±s)
表 7 4组小鼠血清TNF-α的比较(n=10, x±s)
3 讨论

本实验利用Cy对ICR小鼠进行造模[6-9],以破坏小鼠的免疫功能,然后在此基础上给予不同剂量的SF,以考察SF对于免疫低下小鼠的免疫调节作用。胸腺和脾脏是机体极为重要的免疫器官,且当机体的免疫力升高时,二者的质量也会增大,而当免疫低下时,则与之相反。因此,本实验首先观察小鼠胸腺、脾脏指数的变化。本文结果显示,SF高、低剂量组的胸腺(脾脏)指数均高于Cy模型组,说明SF对Cy致免疫抑制小鼠的免疫器官具有很好的保护作用。其次测定血清溶血素水平实验以检测小鼠体液免疫水平的改变,结果显示,SF高、低剂量组均能显著提高小鼠血清抗体生成率,增强机体的体液免疫应答水平。而对于DTH来讲,其反应强度是机体的淋巴细胞参与的结果。当机体的免疫功能较高时,可以增强DTH反应,则左右耳之差(即肿胀度)随之也会变大。小鼠DTH检测发现,SF高、低剂量组的肿胀度要高于Cy模型组,且剂量越高肿胀度越大。SF可明显增强免疫低下小鼠的DTH反应,表明其可大大增强Th1细胞免疫功能。上述实验结果表明,无论从体液免疫还是细胞免疫,SF均显示出很好的免疫增强活性,是一种非常好的免疫保护剂。

TNF-α是由体内单核巨噬细胞、肥大细胞合成和分泌的一种细胞因子,具有广泛的生物学活性,在杀伤靶细胞、促进炎症反应及免疫调节等多方面发挥重要作用。其在机体内的含量与机体的免疫功能状态呈正相关。本文结果显示SF高、低剂量组的小鼠TNF-α外周血的表达及免疫器官mRNA的表达水平相对于Cy模型组明显升高,则说明SF提升机体整体的免疫功能,刺激活化的巨噬细胞释放TNF-α,TNF-α的水平增加,提升机体免疫力。

IL-10多由体内Th2细胞和巨噬细胞产生,对单核巨噬细胞、NK细胞、Th2细胞均有一定的抑制活性[12-13]。与TNF-α相反,IL-10是一种免疫抑制剂,它的表达水平与机体的免疫功能呈负相关,当机体的免疫功能增强时,IL-10的表达水平将会降低,反之,当机体的免疫功能下降时,IL-10的表达水平就会升高。本文结果显示,无论是外周血细胞因子的表达,还是脾细胞mRNA的表达,均显示Cy模型组的IL-10表达水平均高于SF高、低剂量组。由此,SF可促使IL-10表达下降,提高了机体Th2细胞亚群分化和成熟,提高机体免疫力。外周血中IL-10和TNF-α因子的分泌水平的测定,让我们进一步观察研究了SF对机体的免疫增强作用的具体调节机制。上述结果与我们前期的实验结果保持一致[14],再次证明SF对机体具有良好的免疫保护作用。从而为SF在免疫保护和调节方面提供更多的更为全面的研究资料,进一步为SF在癌症的预防和治疗、提高机体免疫力等多方面提供有效的参考。

参考文献
[1] 吴广辉, 毕韬韬. 西兰花营养价值及深加工研究进展[J]. 农产品加工(下半月), 2015(11): 61–63. DOI:10.16693/j.cnki.1671-9646(X).2015.11.019
[2] Appendino G, Bardelli A. Broccoli, PTEN deletion and prostate cancer:where is the link[J]. Mol Cancer, 2010, 9: 308. DOI:10.1186/1476-4598-9-308
[3] 贺云冲, 贾侃, 王川, 等. 西兰花提取物萝卜硫素抑制胃癌和胰腺癌的生长与侵袭[J]. 科技通报, 2015, 31(9): 62–67, 88. DOI:10.3969/j.issn.1001-7119.2015.09.014
[4] Talalay P, Fahey JW. Phytochemicals from cruciferous plants protect against cancer by modulating carcinogen metabolism[J]. J Nutr, 2001, 131(11 Suppl): 3027–3033S.
[5] 姚丹燕, 吴秋云, 李倩, 等. 萝卜硫素调控机制的研究进展[J]. 园艺学报, 2014, 41(5): 1020–1026.
[6] Habibi E, Shokrzadeh M, Ahmadi A, et al. Genoprotective effects of Origanum vulgare ethanolic extract against cyclophosphamide-induced genotoxicity in mouse bone marrow cells[J]. Pharm Biol, 2015, 53(1): 92–97. DOI:10.3109/13880209.2014.910674
[7] 王颖飞, 龙飞, 唐振, 等. 化疗减毒汤对环磷酰胺所致小鼠骨髓抑制的保护作用[J]. 四川大学学报(医学版), 2016, 47(2): 214–216, 261.
[8] Nishikawa T, Miyahara E, Kurauchi K, et al. Mechanisms of Fatal Cardiotoxicity following High-Dose Cyclophosphamide Therapy and a Method for Its Prevention[J]. PloS One, 2015, 10(6): e0131394. DOI:10.1371/journal.pone.0131394
[9] Le XY, Luo P, Gu YP, et al. Interventional effects of squid ink polysaccharides on cyclophosphamide-associated testicular damage in mice[J]. Bratisl Lek Listy, 2015, 116(5): 334–339. DOI:10.4149/bll_2015_063
[10] 刘杨, 陈利琴, 王文斌, 等. 乳腺癌患者血浆中IL-6、IL-8及TNF-α的表达[J]. 贵阳医学院学报, 2016, 41(3): 348–350, 355.
[11] 高远, 白宇娜, 韩名宝, 等. 姜黄素对肿瘤坏死因子-α刺激的INS-1细胞脂联素受体通路的影响[J]. 营养学报, 2016, 38(2): 181–185.
[12] 周琳, 周光炎, 路丽明. IL-10的双向免疫调节作用[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2012, 28(10): 1100–1102, 1106.
[13] Li C, Zhang L, Chen Y, et al. Protective role of adenovirus vector-mediated interleukin-10 gene therapy on endogenous islet β-cells in recent-onset type 1 diabetes in NOD mice[J]. Exp Ther Med, 2016, 11(5): 1625–1632. DOI:10.3892/etm.2016.3169
[14] 高慧婕, 李春霞, 陈玉杰. 萝卜硫素对免疫抑制小鼠的免疫调节作用[J]. 肿瘤防治研究, 2015, 42(6): 564–567. DOI:10.3971/j.issn.1000-8578.2015.06.007