2. 济宁医学院附属济宁市第一人民医院, 济宁 272011
2. Jining No 1.People's Hospital & the Affiliated Hospital of Jining Medical University, Jining 272011, China
蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)具有高发病率和死亡率，严重威胁人类健康[1]。早期脑损伤(early brain injury, EBI)发生在SAH后72 h内，严重影响SAH患者预后，国外学者研究认为EBI为SAH患者不良结局的主要因素[2]。SAH后EBI潜在的病理生理机制迄今仍未阐明，众多研究证实神经炎症在SAH后EBI发生和发展过程中扮演重要角色[3-4]。既往研究发现，选择性磷酸二酯酶3(phosphodiesterase, PDE)抑制剂西洛他唑可以改善SAH后临床结局[5]。本文旨在探讨罗氟司特对SAH后EBI的保护作用及其作用机制，以期为临床用药提供基础实验理论。
1 材料和方法 1.1 材料SPF级健康成年雄性SD大鼠(8周龄)，体重280~300g，由山东省动物实验中心提供(SCXK(京)2012-0001), 所有的动物实验都遵照国家实验动物饲养和使用指标。罗氟司特购自上海麦克林生化科技有限公司(纯度99%)。大鼠白细胞介素1β(IL-1β)ELSA检测试剂盒、大鼠TNF-α ELISA检测试剂盒、大鼠IL-6 ELISA检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。本实验所用其它化学试剂均为国产分析纯。
动物模型制作及分组:将36只健康清洁级雄性SD大鼠随机分为：假手术组(Sham组)、模型对照组(SAH组)、罗氟司特治疗组, 每组12只，采用改良的枕大池一次注自体血法建立SAH大鼠模型[6]。大鼠经腹腔注射10%水合氯醛(0.3ml/100g)，俯卧位固定于立体定位仪上，取头颈部正中切口，充分暴露寰枕膜。翻转大鼠暴露右股动脉，经右股动脉抽取动脉血。操纵定位仪注射旋钮，将自体动脉血(0.1ml/100g)3min内匀速向注入枕大池。待大鼠苏醒后，罗氟司特治疗组经腹腔注射罗氟司特(3mg/kg，1次/d)，SAH组经腹腔注射溶媒(1ml生理盐水+3% DMSO), Sham不给予任何处理。
1.2 神经功能评分SAH术后48h和72h，根据文献报道[7]对各组大鼠行3种神经功能(饮食、行为和神经功能缺损)评分。行为学评分由两名对实验不知情的研究人员执行，且测试顺序是完全随机的，记录实验动物的食欲、活动和神经功能缺损情况，并根据评分标准给出评分。
1.3 rCBF检测SAH术后48h和72h，各组大鼠经腹腔麻醉成功后，固定于脑立体定位仪，取头部正中切口，充分暴露头骨，前囟后2mm，中线左侧旁开3mm，钻孔暴露硬脑膜，采用激光多普勒血流测量仪监测各组大鼠rCBF值。
1.4 IL-1β、TNF-α和IL-6检测于SAH后48h和72h，过量麻醉大鼠，取静脉血1ml，低温离心机(4℃，3000 r/min，10 min)离心，取上清液保存备用。快速断头处死，取新鲜脑组织，快速称取颞叶皮层组织，1:10(W:V)加入4℃ PBS，匀浆30 s，匀浆后低温离心10min(4℃，3000 r/min，10min)，离心完毕后取上清保存备用。取出所有检测标本，室温下复温, ELISA法分别检测IL-1β、TNF-α和IL-6的含量。ELISA检测操作严格按照试剂盒操作说明书步骤进行。
1.5 统计学方法所有实验数据用x±s表示，统计分析采用SPSS19.0软件，组间均数比较采用重复测量方差分析，两两比较采用LSD法。P＜0.05定义为差异具有显著统计学意义。
2 结果 2.1 神经功能评分结果SAH后48、72h，与Sham组[48h:(0.5±0.55) 分；72h：(0.83±0.41) 分]相比，SAH组[48h:(4.67±1.21) 分；72h：(0.33±0.82) 分]大鼠神经行为学评分得分明显升高，差异具有统计学意义(P均＜0.05)。统计分析表明，SAH后48、72h，与SAH组相比较，罗氟司特治疗组[48h:(3.5±0.55) 分；72h：(2.17±0.75) 分]改善了神经功能评分(P均＜0.05)。见图 1。
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图 1 各组大鼠神经功能评分 注：3组间比较，F区间=58.676，P＜0.05;与SAH组相比较，*P＜0.05, n=12 |
Sham组大鼠rCBF相对稳定，SAH组术后rCBF显著降低，SAH后48、72h均低于Sham组，差异具有显著统计学意义(P＜0.05)。SAH后48、72h，与SAH组相比较，罗氟司特治疗组rCBF显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
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表 1 各组大鼠rCBF测定结果比较(n=12) |
Sham组大鼠48、72h外周静脉血中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量呈低水平。SAH后48、72h，与Sham组相比较，SAH组IL-1β、TNF-α和IL-6的含量显著升高，差异均具有统计学意义(均P＜0.05)。SAH后48、72h，与SAH组相比较，罗氟司特治疗组大鼠外周血中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量呈降低趋势，差异均具有统计学意义(均P＜0.05)。见图 2~4。
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图 2 大鼠外周血与大脑皮层中IL-1β含量 注：血液F区间=374.196，P＜0.05，脑皮层F区间=724.595，P＜0.05；与SAH组相比，*P＜0.05，n=12 |
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图 3 大鼠外周血与大脑皮层中TNF-α含量 注：血液F区间=544.397，P＜0.05，脑皮层F区间=447.772，P＜0.001；与SAH组相比，*P＜0.05，n=12 |
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图 4 大鼠外周血与大脑皮层中IL-6含量 注：血液F区间=1049.601，P＜0.05，脑皮层F区间=360.326，P＜0.05；与SAH组相比，*P＜0.05，n=12 |
SAH后48、72h，与Sham组相比较，SAH组IL-1β、TNF-α和IL-6的含量显著升高，差异均具有统计学意义(均P＜0.05)。SAH后48、72h，与SAH组相比较，罗氟司特治疗组脑皮层中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量呈降低趋势，差异均具有统计学意义(均P＜0.05)。见图 2~4。
3 讨论大多数SAH发生由于动脉瘤破裂，大量红细胞溶血生成的氧合血红蛋白被释放了进入蛛网膜下腔。随后氧合血红蛋白诱发一系列应激反应，包括激活炎症反应和大量炎症细胞因子产生[8]。国外学者研究发现，SAH后促炎细胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)增加[9]，促炎细胞因子上调的潜在机制涉及核的激活NF-κB、有丝分裂原蛋白激酶通路的激活和toll样受体4(TLR4) 信号通路[10-11]。SAH后大量炎性因子的产生最终导致脑水肿，血脑屏障通透性增加，氧化应激反应和神经元凋亡等一系列不良后果，是导致SAH后EBI的关键机制。本实验SAH后结果同样证实了，SAH后48h和72h大鼠外周血及脑组织中促炎细胞因子(TNF-α、IL-6的IL-1β)含量增加，从而导致神经功能的恶化。既往研究提示控制SAH后炎性反应可以有效改善EBI。
罗氟司特是高度选择性PDE-4抑制剂，已通过美国食品和药物管理局认证，作为抗炎药物用于严重的慢性阻塞性肺疾病和慢性支气管炎[12]。除作用于呼吸系统以外，神经科学工作者研究发现，其可以有效改善高血压导致的学习记忆损害[13]，降低啮齿类动物的认知功能障碍[14]。在炎症扮演重要角色的神经系统疾病中，如脊髓损伤[15]，脑创伤[16]及缺血性脑卒中[17]，抑制PDE-4可以带来益处。本实验假设罗氟司特可以降低促炎因子，从而降低SAH后EBI。研究结果发现，罗氟司特可以有效降低外周血液及脑内促炎因子的表达，升高SAH后rCBF，从而促进SAH后EBI的恢复。上述研究结果揭示罗氟司特可以通过抑制SAH后EBI发生过程中的炎性反应，从而发挥脑保护作用。
综上，罗氟司特可以显著降低SAH后外周及中枢的促炎因子，改善SAH后rCBF，从而有效降低了SAH后EBI，其详细作用机制及相关信号转导通路有待于进一步研究。
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