苦豆子[学名Sophora alopecuroides L]，为豆科(Leguminosae sp.)槐属(Sophora)，草本植物，主要分布于中国北方的荒漠、半荒漠地区[1-5]，主要成分有蛋白质、糖类、有机酸、黄酮类、色素和生物碱[6]。生物碱属于喹诺里西啶(Quinolizidine)生物碱，包括苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、槐定碱等多种生物碱，以苦参碱和氧化苦参碱含量最高，并且苦豆子生物碱具有清热解毒，抗菌消炎、止痛及杀虫等作用[7-8]。
近年来，苦豆子生物碱因其具有优异的生物活性，被广泛地应用于抗炎药物和环保型杀虫剂中，其生物碱种类及含量的高低直接影响生物碱的药效。目前，同时测定苦豆子多种生物碱的文章报道还不多[9-12]，建立一种同时快速测定苦豆子多种生物碱的方法具有重要意义。本文拟建立一种HPLC测定苦豆子多种生物碱的方法，以苦参碱杀虫剂中的苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、槐定碱4种生物碱进行定性和定量分析，为快速评价苦豆子生物碱相关产品的质量提供理论基础和科学依据。
1 仪器与材料 1.1 仪器LC-10AT高效液相色谱仪、SPD-10A检测器、色谱柱Wondasil C18(日本岛津公司)；KQ-50型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；250μl和1000μl移液器(上海求精生化试剂有限公司)；BP211D精密电子天平(德国赛多利斯公司)。
1.2 材料磷酸二氢钾(天津市鼎盛鑫化工有限公司)；乙腈(山东禹王实业有限公司)；乙醇(天津市科密欧化学试剂有限公司)；苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱和槐果碱标准品(中国药品生物制品检定所)；苦参碱杀虫剂(恒源传业生物科技有限公司)。
2 实验方法 2.1 对照品的制备精密称取苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱和槐果碱标准品对照品20.0mg，置于25ml的容量瓶中，加甲醇使溶解，定容至刻度，摇匀。取对照品溶液分别配制成0.250, 0.235，0.220和0.245mg/ml的4种生物碱对照品溶液和混合对照品溶液。
2.2 供试品溶液的制备精密称取苦参碱杀虫剂0.040g，分别置于50ml的容量瓶中，甲醇定容至刻度，将粗提液经0.45μm的微孔滤膜过滤后，制备得到供试品溶液。样品测定3次，取平均值。
2.3 色谱条件色谱柱：Wondasil C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(12:88, v/v, 三乙胺含量为0.2%)；流速：1.0ml/min；检测波长：205nm；柱温：室温。4种苦豆子生物碱的标准测定色谱图见图 1。
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图 1 4种苦豆子生物碱标准色谱图 注：1.槐定碱; 2.氧化苦参碱; 3.苦参碱; 4.槐果碱 |
分别精密量取4种不同体积的生物碱对照品溶液，用甲醇稀释，分别配制成苦参碱浓度为0.50，0.40，0.27，0.13，0.076mg/ml，氧化苦参碱浓度为0.47，0.31，0.21，0.16，0.084mg/ml，槐定碱浓度为0.12，0.25，0.35，0.40，0.44mg/ml，槐果碱浓度为0.20，0.24，0.35，0.42，0.49mg/ml的系列不同浓度的对照品溶液。测得4种生物碱的回归方程和线性范围。见表 1。
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表 1 4种生物碱的回归方程和线性范围 |
分别取苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱和槐果碱对照品溶液，连续进样5次，每次进样30μl，测定峰面积，测得RSD分别为3.71%，1.77%，2.88%和0.83%(n=5)，表明该方法精密度良好，可以满足生物碱含量测定的要求。
2.6 加标回收率试验精密称取苦参碱杀虫剂样品6份，每份各0.05g，溶于5ml甲醇溶液中，分别加入苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱和槐果碱对照品溶液(0.8mg/ml)各0.5ml，按照回归方程，计算加标回收率，苦参碱的加标回收率在96%~103%范围内，RSD=1.66%(n=3)；氧化苦参碱的加标回收率在97%~104%范围内，RSD=2.39%(n=3)；槐定碱的加标回收率在97%~98%范围内，RSD=0.56%(n=3)；槐果碱的加标回收率在96%~100%范围内，RSD=2.00%(n=3)。表明该方法能够较好的对4种生物碱进行含量测定，具有较高准确度。
2.7 检测限的测定将苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱和槐果碱对照品溶液用甲醇稀释至一定浓度，按照信噪比为3时，确定4种生物碱的检测限，其苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱、槐果碱检测限浓度分别为5.0 × 10-5，4.7 × 10-5，4.4 × 10-5和4.9 × 10-5μg/ml(S/N=3)。
2.8 样品中的4种生物碱含量测定取苦参碱杀虫剂，按照2.2项方法制备供试品溶液，按照2.3项的色谱条件，测定苦参碱杀虫剂中的苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱和槐果碱，其测定色谱图见图 2，苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱和槐果碱质量含量分别为：0.70%，0.28%，0.60%和0.01%。结果表明，苦参碱的含量明显高于其他3种生物碱的含量，并且槐果碱的含量最低。
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图 2 苦参碱杀虫剂4中生物碱HPLC图 注：1.槐定碱; 2.氧化苦参碱; 3.苦参碱; 4.槐果碱 |
苦豆子中的生物碱成分非常复杂，结构相似，难以快速、准确的进行定量测定多种生物碱，本研究优化了HPLC的检测条件，建立了一种快速同时测定4种苦豆子生物碱的方法，该方法操作简便，灵敏度高，重复性好，准确度高。本文测得苦参碱杀虫剂中的苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱和槐果碱含量分别为：0.70%, 0.28%, 0.60%, 0.01%。本文建立的HPLC法可用于快速检测苦参碱杀虫剂中的4种生物碱，为监管部门提供检测依据，有一定的推广应用价值。
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