2. 济宁医学院免疫学与分子医学研究所, 济宁 272067
2. Institute of Immunology and Molecular Medicine, Jining Medical University, Jining 272067, China
高盐饮食与心血管疾病[1-2]、慢性炎症[3]、自身免疫性疾病以及肿瘤有着密切的关系，盐在高血压疾病过程的作用已经被广泛地研究和证实[4-5]。随着对盐在多种不同疾病发病过程中的深入研究，使得很多疾病的预防和治疗有了新的突破和进展。最新研究发现高盐可能参与内毒素介导的败血症休克，并在炎症反应机制中发挥着至关重要的作用[6]。本实验拟观察高盐饮食对内毒素休克小鼠炎症因子表达的影响。
1 材料和方法 1.1 动物及器材C57BL/6小鼠，雌性，6~8周，体重16~20g，购于济南朋悦实验动物技术有限公司，SPF级饲养。高速冷冻离心机、全自动酶标分析仪购自美国Thermo Fisher公司，PCR仪购自美国BIO-RAD公司，PCR分析仪购自杭州博日科技有限公司。
1.2 主要试剂TRIzol、反转录试剂盒 (美国Thermo Fisher公司)；SYBR Green MasterMix (美国Vazyme公司)；IL-6和IL-12p40 ELISA试剂盒 (美国BioLegend公司)；LPS (美国Sigma公司)。
1.3 方法 1.3.1 动物模型制备及标本采集C57BL/6小鼠适应喂养1周后，将20只小鼠随机分为2组，每组各10只，分别为高盐饮食组和正常饮食组。高盐饮食组饮用含2.5 % NaCl盐水，正常饮食组饮用不含NaCl的普通饮用水。14d后，2组分别腹腔注射LPS (500 μg/只)，观察致死率；腹腔注射LPS (200 μg/只)，12h后摘眼球取血并断颈处死，取血清、脾脏和腹腔细胞检测IL-6和IL-12p40含量。
1.3.2 小鼠腹腔和脾脏细胞的制备颈部脱臼法处死小鼠，置75 %酒精浸泡消毒5min，置动物于解剖台上，固定四肢，剪开腹壁暴露出腹膜，用5 ml注射器从小鼠下腹壁将5 ml PBS注入腹腔中，同时揉压腹膜壁，反复冲洗3~5次，吸出液体，离心后得到腹腔细胞。剪开腹壁取出脾脏，取1/3脾脏剪成碎块后，用毛玻片轻柔研磨组织碎片，经400目滤网制成单细胞悬液，离心后得到脾脏细胞。
1.3.3 小鼠血清IL-6和IL-12p40的水平检测摘眼球取血后4000 rpm，10 min离心，取得血清后放于-80℃保存。使用IL-6和IL-12p40的ELISA试剂盒检测其在血清中浓度，按照试剂盒说明书操作。
1.3.4 实时定量PCR (qPCR) 检测脾脏和腹腔细胞中IL-6和IL-12p40的表达从Pubmed数据库中获取小鼠的IL-6和IL-12p40序列，引物购买于上海生工生物工程公司。甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (GAPDH) 作为内参对照。具体引物序列如下：
IL-6
上游引物：5’-CCAGAAACCGCTATGAAGTTCCT-3,
下游引物：5’-CACCAGCATCAGTCCCAAG-3’;
IL-12p40
上游引物：5’-GACCATCACTGTCAAAGAGTTT CTAGAT-3’,
下游引物：5’-AGGAAAGTCTTGTTTTTGAAA TTTTTTAA-3’；
GAPDH
上游引物：5’-CTAGAG AGCTGACAGTGGGTAT-3’,
下游引物：5’-AGACGACCAATGCGTCCAAA-3’。
用TRIzol提取总的RNA，用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒合成cDNA，具体步骤按照试剂说明进行，将20 μl体系放入PCR仪中，进行qPCR。反应条件为：95℃ 10 min预变性；95 ℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40个循环。qPCR的结果分析：2－ΔΔCt法，ΔΔCt＝(样本的Ct值-内参的Ct值)-(对照组Ct值-内参的Ct值)。
1.4 统计学方法采用GraphPad Prism 5统计软件进行数据分析。
2 结果 2.1 高盐饮食增加小鼠内毒素休克的死亡率高盐饮食能够显著增加内毒素引起的小鼠死亡率。在腹腔注射LPS 96 h后，高盐饮食组小鼠全部死亡，而正常饮食组小鼠近有50%的小鼠仍然存活。见图 1。
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图 1 高盐饮食增加小鼠内毒素休克的死亡率 |
高盐饮食组小鼠血清中IL-6和IL-12p40的表达较正常饮食组明显升高，差异具有统计学意义 (t=5.534，P＜0.01；t= 2.906，P＜0.05)，其中IL-12p40升高的更为明显。见图 2。
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图 2 高盐饮食促进内毒素休克小鼠血清中IL-6和IL-12p40的表达 注：与正常饮食组相比，*P＜0.05，**P＜0.01 |
高盐饮食组小鼠脾脏细胞中IL-6和IL-12p40的表达较正常饮食组明显升高，差异具有统计学意义 (t=4.075，P＜0.05；t=4.758，P＜0.01)。特别是在高盐饮食小鼠腹腔细胞中，炎症因子IL-6和IL-12p40的表达水平升高的更加明显，差异具有统计学意义 (t=25.47，P＜0.001；t=8.589，P＜0.001)。见图 3。
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图 3 高盐促进内毒素休克小鼠中IL-6和IL-12p40 mRNA水平的表达 注：A为腹腔细胞中IL-6和IL-12p40的表达，B为脾细胞IL-6和IL-12p40的表达；与正常饮食组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；①② 分别为高盐饮食组和正常饮食组的GAPDH基因的扩增曲线，③④ 分别为高盐饮食组和正常饮食组IL-12 p40和IL-6基因的扩增曲线 |
内毒素休克模型是目前最接近感染性休克患者病情的动物模型[7]。因此，我们利用内毒素休克模型来探究高盐对感染性休克等炎症性疾病的影响，为临床预防和治疗提供理论依据。
盐是细胞存活不可或缺的矿物质，其对于机体内一些细胞的功能是至关重要的，比如维持渗透压、体内液体的分布、正常pH值和大部分的新陈代谢过程等[8]。高盐与多种疾病的发病风险都存在着一定的关系，比如心血管疾病、慢性炎症、自身免疫性疾病以及肿瘤[9-10]。大量研究表明高盐不仅能升高血压，同时也会导致组织损伤，如左心室肥厚[11]。近几年，对于盐在多种疾病中所起到的病理、生理作用引起了广泛的关注，很多研究人员也试图通过这个靶点来预防和治疗某些疾病。
有研究统计，临床上多数的脓毒血症是由于革兰氏阴性菌引起的，已被公认为引起脓毒血症的主要分子是位于革兰氏阴性菌的细胞壁上的LPS，也称为内毒素。在LPS的作用下，体内会生成“细胞因子风暴”(cytokine storm)，即会产生很多的IL-6、IL-12、TNF-α等，从而引起机体炎症性失控性级联反应，最终引起内毒素休克、组织损伤和多器官功能障碍[12]。很多病理发生发展的关键环节是炎症因子的释放。值得注意的是，有研究发现在皮肤炎症部位有钠离子的聚积，在高盐饮食的动物中钠离子的聚积能够增加皮肤的抗菌防御能力[13]。然而钠离子的聚积在炎症反应中究竟发挥什么样的作用鲜有报道。本文就高盐对内毒素休克小鼠的炎症因子的影响做了初步的探讨。
当LPS所引起的内毒素休克发生时，机体免疫细胞因受到刺激发生活化，从而引发一系列的炎症反应[14]。IL-6可参与机体的免疫应答，诱导多种免疫细胞活化；IL-12p40是树突状细胞分泌的重要细胞因子，它可促使T细胞活化，激活免疫细胞的应答反应。因此IL-6和IL-12p40在内毒素休克的炎症反应中发挥着重要的作用。
在本研究中，我们发现高盐饮食显著加重了内毒素引起的小鼠死亡。这就表明高盐饮食组小鼠不耐受内毒素休克所带来的损伤。随后我们发现高盐饮食组小鼠血清、腹腔和脾脏细胞中，炎症因子IL-6和IL-12p40的表达较正常饮食小鼠显著升高，高盐加重了LPS引起的细胞因子风暴，即加重了LPS引起的内毒素休克。研究表明LPS广泛作用于机体多组织、器官，其中最主要的效应细胞是内皮细胞、巨噬细胞和中性粒细胞[15]，然而高盐对内毒素休克的作用具体的机制仍不是很清楚，这也是我们下一步的要继续探索的。
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